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选好ECL,让你的WB实验熠熠发光

发布时间:2021年03月18日 浏览次数:298

蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB),一种比较常规的生物学实验,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法,通过分析条带大小和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织样本表达情况的信息。做WB实验时,选好一款ECL发光液对于实验的成功很重要,否则容易发生检测不到目的条带、目的条带浅、曝光时间较长及发光信号持续时间短等问题。那面对市场上纷繁多样的ECL,我们该如何选择一款适合自己实验的呢?选对ECL后,我们又将如何使用呢?对于“不约而至”的WB常见实验问题,我们又该解决呢?接下来,小编将带着大家一起重新认识一下,熟悉又陌生的ECL化学发光液。

一、ECL的工作原理:

化学发光技术经过多年的发展,已经有多种发光体系,但实验室最常用的仍然是基于鲁米诺(Luminol)或者其衍生物(异鲁米诺等)的技术体系。鲁米诺试剂通常稳定存在且不会发射光信号,一旦和特定性的酶进行相互作用之后,能够转换成一种发光产物。

ECL免疫印迹化学发光溶液是一种旨在通过非放射性HRP(辣根过氧化酶)发光系统,检测固定在固相膜上(如NC、PVDF等)的30至50皮克以上蛋白,经X光片(放射自显影片)或者其他成像方法(化学发光成像仪)感光记录其免疫印迹的实验辅助试剂。作为检测免疫印迹过程中HRP标记抗体的化学发光底物,ECL主要由两部分组成,过氧化物试剂和鲁米诺增强剂,如果要制备工作液,需要将两种组分等体积混合在一起。在WB实验中具体表现为:蛋白质在电泳后转移到印迹膜上,以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白。洗膜后用混合等体积两种组分的ECL化学发光液均匀加到印迹膜上,室温孵育膜数分钟,经压片或者化学成像仪检测,可获得清晰的目的蛋白条带。

ECL工作原理

注意:在大多数的ECL系统中,偶联于二抗上的辣根过氧化物酶(HRP)被用来催化鲁米诺发生氧化,从而产生化学发光。在发光过程中只要HRP有活性,是可以在一段时间内重复加入发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的;同时在发光过程中若有物质污染了膜的话,也有可能使膜上的HRP发生失活,导致不能正常显示出目的蛋白条带。

二、ECL的选择

在选择ECL时,我们需要考虑的因素有ECL的灵敏度、靶蛋白的丰度(高、低)、蛋白样品量(较大、有限)、可用检测仪器类型以及抗体可用性,由此选择最适合的HRP化学发光底物。目前Abbkine现有的SuperLumia™ ECL底物系列主要包括SuperLumia ECL HRP Substrate、SuperLumia ECL Plus HRP Substrate。SuperLumiaTM ECL底物系列是一类即用型的化学发光试剂,用于基于HRP方法的免疫印迹检测,显著的优点有:

  • 灵敏度高:在飞克级别ECL产品中,具有最高的灵敏度。极佳的灵敏度,对样品和抗体的需求量更低;
  • 信号稳定性强:信号强烈且可长时持续;
  • 操作简单:两种试剂预混后,直接加到印迹膜上使用;
  • 兼容性:对于PVDF和NC膜一样适用。
  • 性能稳定:4-8°C保存一年后,显色效果无明显差异。
  • 检测方法通用:可使用X光胶片曝光,也可直接使用化学发光成像仪进行检测。

不管是检测总蛋白还是核蛋白,Abbkine总有一款ECL适合你!

产品名称 产品货号 规格(ml)
SuperLumia ECL HRP Substrate Kit(高敏) K22020 30/100/200/500
SuperLumia ECL Plus HRP Substrate Kit(超敏) K22030 30/100/200/500

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三、ECL使用以及注意事项:

选择适合的ECL后,接下来便是需要规范的使用:

1、常规电泳、转膜、HRP标记抗体孵育、洗膜。

注意:用HRP标记IgG(注意使用HRP标记的一抗/内参抗体,或使用HRP标记的二抗进行孵育)。

2、在抗体孵育完成后,注意按照标准操作进行洗膜,洗膜完成后,新鲜配制发光工作液:取等体积试剂A和试剂B混合均匀。

注意:ECL工作液配制过程中吸取试剂A和试剂B时务必跟换枪头。

  •  立即使用配置好的工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有减低。

3、印迹膜蛋白面朝上,用ECL工作液均匀滴加至印迹膜。用镊子夹住印迹膜进行压片检测或化学发光成像仪检测。

注意:ECL工作液使用量大约为(0.5 mL发光工作液/5cm*9cm膜)或根据实际膜的大小确定用量。

  • 曝光时间过长不会增加灵敏度,可能会导致非特异性条带出现,加工作液到膜上后,可立即通过通过X光胶片、化学发光成像仪等进行曝光处理。
  • 曝光时间在几秒到几分钟,蛋白丰度越高,所需曝光时间越短。

四、WB实验常见问题

实验问题 原因分析 解决方案
信号强度低 样本蛋白表达量不足 适当增加上样量,或蛋白表达量较高的样本作为阳性对照
蛋白质降解 注意蛋白酶抑制剂PMSF的使用,所制备的样品尽快检测或妥善保存
转膜时间不恰当或膜选择的不合适 使用适当孔径的膜,同时优化转膜时间
抗体的不恰当使用 抗体的反应种属与实验类型需要能够满足实验的需求;此外抗体的稀释比、孵育时间等问题也需要在试验中不断优化
抗原被封闭液遮蔽 换用不同的封闭液,优化封闭液中蛋白质浓度并缩短封闭时间
甲醇浓度过高 适当降低甲醇浓度或者使用乙醇、丙醇代替
曝光时间过短 延长曝光时间
蛋与抗体结合率低 减少洗膜次数或缩短洗膜时间,降低洗膜液中NaCl浓度等
背景过高 过度曝光 降低曝光时间
一抗、二抗浓度太高 降低抗体浓度,延长封闭时间
抗体未清洗干净 增加洗膜次数
封闭不完全 优化封闭条件
封闭试剂不合适 更换封闭液
抗体特异性差 更换优质抗体
出现非特异性条带 反应系统中HRP量过多 稀释HRP标记物
SDS引起蛋白非特异性结合 Western blot 过程中避免使用SDS
抗体特异性差 更换优质抗体
抗体的非特异性结合 通常认为,多抗的特异性不如单抗,更容易产性非特异性条带,而适当降低抗体的浓度有助于减少杂带
封闭不足 增加封闭时间或使用其他封闭剂
蛋白质降解 采用新鲜制备的或是冻融次数较

少的样品

膜上散布不均匀的污点 转膜时有气泡 确保在转膜过程中将气泡排除干净
试剂、仪器等污染 每次实验前后注意清理实验仪器,同时及时更换出现问题的试剂
抗体孵育时与膜接触不充分 确保在抗体孵育过程中,液体总量足够,同时将抗体均匀配置,并在摇晃的条件下进行孵育
曝光时间 过度曝光会导致斑点更明显,建议采用合适的曝光时间
膜干燥 保证有充分的反应液,避免出现干膜现象
条带弥散或形状怪异 电泳缓冲液存放过久 及时更换新的缓冲液
制胶问题 配胶时要保证充分混匀,均匀凝胶,上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡
上样过高 上样时需保证样品量一致且适当, 并保持相同的、较低的盐离子浓度
电泳时电压、电流过高 建议使用合适的电泳条件并保持低温
电极不平衡 上样时在无样品的胶孔中加入等量样品缓冲液
Western Blot“淬灭” 含HRP的抗体 对抗体方面来说,可以采用适当降低抗体的浓度,发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题
发光液 对发光试剂来说,可以选用发光稳定的ECL发光液来解决“淬灭”的问题
ECL发光液失效 过了保质期 建议及时更换新的ECL发光液
未避光保存 ECL发光液里的鲁米诺等发光成分很容易因为光而失活,所以需要避光保存

五、相关产品推荐

货号 品名
A01010 Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody (1C7)
A01020 Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody (2B5)
A01030 Anti-β-Tubulin Mouse Monoclonal Antibody (3G6)
A01050 Anti-Plant Actin Mouse Monoclonal Antibody (3T3)
A01110 Anti-Rubisco (Large Chain) Monoclonal Antibody (9Y6)
BMM3001 Colorcode Prestained Protein Marker (10-180 kDa)
BMM3002 Colorcode Prestained Protein Marker (15-130 kDa)

 

Abbkine以特色的蛋白质检生产与测试剂起家,致力于创新和研发各类抗体、生化试剂、蛋白质和实验试剂盒,以期望为全球科研工作者提供革新的解决方案。我们很自豪地为客户提供如下特色产品线,并会一如既往地开发新型的、高品质的、买得起的生命科学研究和诊断试剂产品。 企业使命:激发我们内在的创造力,提供有竞争力的生物医学产品和服务,持续为客户创造最大价值 亚科因生物定位:服务于细胞和蛋白研究全球用户,以应用流程和产品组合的方式为用户提供经济型和技术型的产品解决方案。

 

 

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