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免疫沉淀全套解决方案-逐步击破免疫沉淀关键步骤!

发布时间:2020年02月14日 浏览次数:390

第一步:了解免疫沉淀是什么?我为什么要做免疫沉淀呢?

免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)是利用抗原抗体特异性反应,从特定混合物(通常是细胞裂解液或表达上清)中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的IP实验是抗体与目的蛋白结合后,再与蛋白Protein A /G(结合抗体Fc片段)偶联的琼脂糖或磁珠孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物,复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤,用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。

(传统IP原理图)

总结

IP的整个过程我需要用到的关键工具有:

货号 产品名称
BMR20500 PurKine™ Protein A Resin
BMR20504 PurKine™ Protein A Resin 4FF
BMR20600 PurKine™ Protein G Resin
BMR20604 PurKine™ Protein G Resin 4FF
BMR20704 PurKine™ Protein A/G Resin 4FF

第二步:发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免疫沉淀?

某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀,如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适,所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等,可以采用一个表位标记蛋白后,再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于IP实验,涉及flag、HA、His、Myc等标签,以满足大多数客户的需求。

特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体,能最大限度优化免疫沉淀实验,节省时间和成本。

1)原理:省去了Protein A/G与抗原-抗体复合物结合的步骤,且解决了Protein A/G和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后,通过离心或使用磁力架,将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度,稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合。

(琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于IP)

2)选择指南

货号 产品名称
A02010AGB Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose
A02010MGB Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads
A02040AGB Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose
A02040MGB Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads
A02050AGB Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose
A02050MGB Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads
A02060AGB Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose
A02060MGB Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads

第三步:免疫沉淀后WB (IP-WB)出现重链、轻链干扰,怎么办?

在免疫沉淀实验后的WB验证环节中,当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时,通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链(50kDa)和轻链(25kDa)两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时,就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰,

方法一:选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30KD,为了避免抗体轻链的干扰,选择重链特异性二抗;如果目标蛋白分子量大于30KD,为了避免抗体重链的干扰,选择轻链特异性二抗;

选择指南:

货号 产品名称 描述
A25012 IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS 轻链特异性
A25022 IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 轻链特异性
A25112 IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS 重链特异性
A25222 IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS 重链特异性

(使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 轻链特异性二抗检 测NUP50蛋白的IP结 果,完美解决重链干扰问题! CAT #: A25022

 方法二:选择WB一抗时,选择和IP用一抗不同的种属,避免IP一抗的干扰;

方法三:选择HRP直接偶联的WB一抗,省去二抗的步骤。

免疫沉淀三步击破,你掌握了吗?如有疑问,欢迎来撩!

 

 

 

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