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Abbkine免疫沉淀(IP)实验标准操作规程

发布时间:2021年01月06日 浏览次数:350

定义:

免疫沉淀是一种纯化蛋白质的方法。将我们感兴趣的一种蛋白质的抗体与细胞提取液孵育,以使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用蛋白A/G耦合的琼脂糖凝胶,从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离出来。然后样品可以通过SDS-PAGE分离出来进行Western blot分析。

试剂:

裂解缓冲液:0-1 M盐;0.1-2%去污剂,非离子型;0.01-0.5%去污剂,离子型;0-10 mM 二价阳离子;0-5 mM EDTA;pH 值:6-9

变性裂解液:RIPA(放射免疫沉淀法)缓冲液,不含去污剂的可溶性蛋白裂解液,变性裂解液或用于不溶性抗原缓冲液的去污剂

蛋白酶抑制剂:混合(“鸡尾酒”)的蛋白酶和磷酸酶抑制剂

无菌PBS pH 值7.4

无菌PBS-牛血清白蛋白1% W/ V(过滤)

TBST 缓冲液

蛋白免疫印迹实验的加样/样品缓冲液

100 mM EDTA 贮备液:1.86 g EDTA 溶解到40 mL水中。加氢氧化钠调整pH至7.4。最后定容到50 mL。

步骤:

裂解物制备

培养细胞的裂解

非变性:

1.将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的PBS洗涤细胞。

2.吸干PBS 后,再加入冰冷的裂解液(每107细胞/100 mm2 培养皿/150 cm2 培养瓶加1 mL,每5x106 细胞/ 60 mm2 培养皿/ 75 cm2 培养瓶加0.5 mL)。

3.用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下,然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的EP管中。

4.4°C 持续振荡30分钟。

5.放入微型离心机4°C离心。

您可能要根据细胞的类型更改离心力和时间。一个准则就是12,000 rpm 20分钟,但是这必须由最终用户决定(如白细胞需要轻度离心)。

6.从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管(放在冰上)中,弃沉淀。

变性:

1.加100 μL变性裂解液至0.5-2 × 107个细胞中。

2.用涡旋混合器最大速度剧烈震荡2-3秒。将细胞悬液转入EP管。

3.样品加热95°C 5分钟变性。

4.用0.9 mL非变性裂解液稀释悬液,轻轻混合。(非变性裂解液中过量1% Triton X – 100 可以淬灭原来变性缓冲液中的SDS)。

5.将裂解的悬液通过1 mL注射器针头5-10次,把DNA打成片段。

6.冰上孵育5分钟。

7.进行免疫沉淀反应。

组织裂解

  1. 用干净器械解剖所要的组织,最好在冰上,并快速操作以防止蛋白酶降解。
  2. 将组织放入圆底离心管中,浸入液氮中“速冻”。样本在-80°C储存备以后使用或放在冰上立即匀浆。
  3. 对于约5 mg组织,向管中迅速加入约300 μL裂解液并用电动匀浆器均浆。
  4. 裂解液冲洗刀片两次,每次300 μL,然后4°C 持续振荡2 小时(将回旋振荡器放入冰箱)。

注:裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释,以避免蛋白质损失,并尽量减少样品体积以便凝胶上样。最小浓度为0.1 mg/mL;最佳浓度为1-5 mg/mL。

  1. 微型离心机4°C 12000 rpm 离心20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管(放在冰上)中,弃沉淀。

裂解物的预清除程序

  1. 裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到agarose(琼脂糖)或Sepharose beads (凝胶琼脂糖珠)。用无关抗体或血清
  2. 预清除,可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是,如果最后蛋白质是由免疫印迹实验检测,预清除未必必要,除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。

1.加入50 μL同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体到1ml 裂解物中,在冰上孵育1 小时。

2加入100 μL珠浆。

3.4°C 孵育10-30 分钟并轻轻搅拌。

4.微型离心机14000g 4°C 离心10 分钟。

5.丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。为了提高收率,珠子可用裂解液洗涤1或2次以上,并将上清收集在一起。

免疫沉淀

1.在冰上预冷离心管中加入10-50 μg含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。

通常在预实验中,通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。

您可以查看抗体数据表获得建议抗体的浓度。以下供参考使用:

  • 1-5 μL多克隆抗体血清
  • 1 μg 亲和纯化的多克隆抗体
  • 0.2-1 μL腹水(单克隆抗体)
  • 20-100 μL培养液上清(单克隆抗体)

2.样品和抗体孵育的固定时间4°C 1-12 小时(过夜),最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。

3.同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体,选择蛋白G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体,蛋白A 偶联琼脂糖珠通常是

适合的。如果买来的珠子是粉末,100 mg的珠子与1 mL 0.1M PBS 孵育,洗1 小时后珠子膨胀起来,然后离心,去除上清。加入1 mL 含0.1% BSA (牛血清白蛋白) PBS,混合1 小时,PBS洗涤2次。去除上清并加入400 μL含蛋白酶抑制剂的缓冲液(可与裂解液相同)就可以使用了。它可以在4°C储存几天;在含0.02%叠氮钠的PBS 里会保存更长时间(使用当天用新鲜裂解液充分洗涤珠子)。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。

4.浆料混合好,向每个样本中加入70-100 μL。始终保持样品在冰上。珠子将倾向于粘着吸头,所以尽量减少珠子在吸管中运动并使用从尖端切断5 mm的吸头。

5.裂解珠子混合液4°C孵育4小时并旋转振荡(最佳孵育时间可由预实验确定)。

6.当孵育结束后,管子离心,去除上清液并用细胞裂解液洗涤珠子3次(每次4°C离心去除上清)。

7.最后,去除最后一次上清并加入25-50 μL 2×上样缓冲液。95-100°C 煮沸5分钟,以变性蛋白质并将其与蛋白- A /G 珠子分离,随后离心并保持上清含有蛋白质。然后,您可以冻存样品或进行SDS – PAGE 电泳。

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