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亲,琼脂糖珠or磁珠,你还没做出选择吗?

发布时间:2021年04月14日 浏览次数:360

免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。IP是采用固定在微珠支持物上的特定抗体,从复杂的混合物中,纯化单一抗原的实验。长久以来,琼脂糖珠(也称琼脂糖树脂)是免疫沉淀实验中的固相支持物常用的材料。而目前,磁珠已经大幅取代琼脂糖珠,成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首先选择。那说起磁珠和琼脂糖珠,你能分清两者之间的区别吗?到底选择哪种填料,适合你的蛋白?免疫沉淀中,如果某些目标蛋白没有对应的特异性抗体,我们该如何操作?

一、琼脂糖珠

琼脂糖珠海绵状的结构(直径50-150μm)可以结合抗体(继而结合靶蛋白),它能够直接高效、快速结合抗体,而不需借助特殊的专业设备。此外,琼脂糖树脂是多孔的,这使得它们拥有更大的表面积可与蛋白质相互接触,具有更高的结合载量。在纯化大量蛋白的时候,传统的琼脂糖偶联抗体是IP实验的完美选择。

Agarose Beads

(选自网络)

但值得注意的是,在免疫沉淀实验中,抗体的量常常不足以满足琼脂糖珠的饱和荷载量,没有被抗体覆盖的琼脂糖珠的部分则可以自由地结合任何可粘附的物质,这种非特异性结合升高引起背景信号升高,这时,“高荷载量优势”会变成“高荷载量劣势”。对裂解样本进行预处理操作,是去除非特异性结合物最为简单有效的方法。不仅如此,多孔的结构会带来如下问题:

  • 抗体被困在孔内,难以洗去,因此需要大量的洗涤来降低背景
  • 免疫沉淀的洗涤是在微量离心管中进行的,液体之间的交换通过移液枪来完成,很容易丢失样品
  • 微球上的抗体与目标蛋白接触的慢,需要长的孵育时间
  • 长的孵育时间及大量的洗涤导致目标蛋白的机械及生物(蛋白酶水解)损失

而所有这些变化意味实验结果可能并不能如我们所愿进行复制。

二、磁珠

与琼脂糖珠不同,磁珠是固体,抗体的结合仅限于磁珠的表面。磁珠(直径1-4 μm)明显小于琼脂糖珠,尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力,但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多,使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。其可重复性、纯度以及结果背景均好于琼脂糖。

Magnetic Beads

(选自网络)

磁性微球不是多孔的,有磁性,这意味着:

  • 没有使抗体藏在深处的隐藏表面,所需的洗涤次数减少
  • 微球上的抗体与目标蛋白很快接触,孵育时间减少
  • 少的洗涤次数及快的孵育时间意味着目标蛋白被蛋白酶水解的机会减少
  • 磁力架快速分离沉淀和上清液,从而降低了丢失样品的机会。节约了操作时间,使操作更自动化。

操作中变量的减少使得实验很容易再复制,在日常小规模、快速处理多个样品的IP实验时,磁珠更简单、更快速。然而,对于某些应用来说,结合能力可能不够高,且成本高于琼脂糖树脂。

三、为使大家更清楚的认识琼脂糖珠和磁珠的区别以及在免疫沉淀中的运用,请跟着小编进入以下快问快答环节。

1、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁的结合能力强?

琼脂糖珠。由于琼脂糖珠直径较大且具有海绵状结构,因而比磁珠有更大的表面积和更大的结合能力。但是琼脂糖珠的可变多孔径会使抗体会落入孔内,导致结合受限,尤其是超大蛋白(一般是蛋白复合物)的结合,并且抗体可能会在洗涤步骤(离心)中流失。另外,琼脂糖珠的非特异性结合能力大于磁珠。

2、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁的背景高?

琼脂糖珠。多孔结构,可以吸附更多蛋白,当然也包括杂蛋白。最好预处理一下再上样。磁珠表面光滑,背景低,预处理这步可跳过。

3、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁的抗体消耗少?

磁珠。如果你的抗体珍贵(真贵),磁珠是个好选择。

4、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁更简单快速?

磁珠。由于琼脂糖珠免疫沉淀需要较长的孵育时间,预处理步骤和多次离心,所以其需要大量的手动操作,总时间为1-1.5小时。相反,磁珠免疫沉淀反应不需要离心,配合使用磁性分离架磁性分离,在30分钟内即可完成实验,因此可以在较短时间内轻松处理并获得较多样本的分析数据。

5、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁更自动化?

磁珠。磁珠操作简便,因此可以使用自动化免疫沉淀设备,不仅节省了工作量和时间,还可以应用于高通量。

6、琼脂糖珠 VS 磁珠,谁的成本更高?

免疫沉淀中设计微珠的成本主要取决于免疫沉淀方法和每个免疫沉淀反应所需要的微珠量

琼脂糖珠:琼脂糖珠必须通过离心浓缩在管底部,并在每次孵育和洗涤除去上清液,通常需要肉眼识别管底部的琼脂糖珠,因此,每个免疫沉淀实验至少需要使用 25-50 μL 的琼脂糖珠。

磁珠:采用磁性分离,无需设定最小体积的的磁珠使用量,用量仅取决于目的蛋白和免疫沉淀抗体。

当然,在使用琼脂糖珠的过程中,可以使用过滤离心柱代替普通的微量离心管,该离心柱包含一个过滤器,允许通过短暂的离心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流过,因此可以显著减少每个反应所需的琼脂糖珠使用量。

7、琼脂糖珠 VS 磁珠,样本体积小于2 mL时,谁更适用?

当样本体积小于2 mL。建议使用磁珠。在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时,以及进行手动和自动化标准 IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反应并立即用于后续检测分析时,磁珠是最佳选择。

而当样品体积> 2 mL,建议使用琼脂糖珠。当抗体成本较低并且想要纯化大量目的蛋白用于多种下游分析时,琼脂糖珠是最佳选择。

8、如果使用AKTA,磁珠还是琼脂糖珠?

琼脂糖珠。

9、如果使用磁珠,你还需要啥?

磁力架或者磁力系统。

10、免疫沉淀中,当某些目标蛋白没有对应的特异性抗体(抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适,所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白)而无法进行时,该如何做?

可以采用一个表位标记蛋白后,再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。表位标记蛋白的免疫沉淀可用于确定蛋白的细胞定位、研究翻译后修饰或检测标记蛋白与其它蛋白之间的相互作用。

11、常用的琼脂糖/磁珠偶联标签抗体有哪些?

Flag(DDDDK)标签、HA标签、His标签、Myc标签等。例如Abbkine琼脂糖/磁珠偶联标签抗体有着诸多特点&优势可满足你的各种实验需要:

  • 高特异性—高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度免疫沉淀
  • 低背景—稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合
  • 规格灵活:100ul, 400ul, 2ml,多规格可供选择。满足不同规模的免疫沉淀需求
  • 操作方便—产品说明书提供了免疫沉淀优化方案,一次免疫沉淀时间约1 - 2小时
  • 兼容性强—填料可以兼容手动及自动化操作

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