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听说你在寻找一款活性氧(ROS)检测试剂盒

发布时间:2021年04月27日 浏览次数:430

听说很多小伙伴们都在寻找检测细胞活性氧(ROS)水平的试剂盒?带着大家的殷殷期盼,Abbkine的专家们经过数月的苦心专研,终于研制出了CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒(荧光法)(货号#KTB1910)这么一款全新的产品。话不多说,大家一起认识一下这位 “新朋友”吧!

活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 是细胞代谢过程中产生的一系列含氧物质,包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基以及具有高氧化活性的活性氧代谢产物,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。其中,细胞内活性氧的升高是细胞凋亡的标志之一。活性氧主要由中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞为代表的免疫细胞受到刺激后产生,其它体细胞在应激条件下线粒体电子传递异常也会产生活性氧。免疫细胞产生的活性氧能够抵御微生物的感染。在病理条件下,过度产生的活性氧也会导致机体损伤和引发各种疾病。活性氧(ROS)参与许多退行性神经系统病症,如阿兹海默症、帕金森症、萎缩性脊髓侧索硬化以及年老或外伤导致的脑功能紊乱等。此外活性氧是植物体内正常代谢的信号小分子,在植物的生长发育和抗逆反应中具有重要作用。

目前各领域中常见的四种ROS的检测分析方法有:化学发发光法、荧光探针法、分光光度法、电子顺磁共振法。其中荧光探针法是利用ROS的高氧化性与荧光探针发生反应,当生成物与原探针的荧光效应有较大差别时,可通过对荧光强度的测定间接检测ROS的存在与含量。该方法拥有较高灵敏度与精度,操作简便,重复性好等优点,在生物领域、光催化领域中等得到广泛应用。

CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒(货号#KTB1910)提供了一种简单、灵敏、快速的ROS检测方法,其原理是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的酯酶水解,形成DCFH,DCFH无荧光且不能通透细胞膜,其可以被细胞内的活性氧(ROS)氧化生成有荧光的DCF,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测和观察活细胞内DCF的荧光信号强度,即可以分析细胞活性氧的水平。

KTB1910 CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒组分如下:

试剂盒组分 规格 储存条件
50T 100T
DCFH-DA (10 mM) 0.05mL 0.1mL -20℃避光保存

KTB1910 CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒的操作步骤如下:

对于刺激时间较短(通常为2 h以内)的细胞,建议先装载探针,后用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞;对于需要较长时间刺激(通常为6 h以上)的细胞,建议先用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞,后装载探针。

1、原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞)

a) 细胞准备:检测前一天细胞铺板,确保检测时细胞数量小于5×105个/mL;

b) 药物诱导:去除细胞培养液,加入无血清培养基稀释的药物处理细胞,于37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间根据药物特性和细胞类型决定;

c) (选做) 阳性对照:用无血清培养液稀释阳性对照H2O2, 100 mM稀释到常用工作浓度100 μM,加入细胞,37℃避光孵育 30 min-4 h,为提高活性氧水平,不同细胞类型存在差异。例如:HeLa 细胞需处理30-60 min;

仅在阳性对照孔中加入,其余试验组不需要加阳性对照。

d) ROS 探针准备:用无血清培养液稀释 DCFH-DA,使其终浓度为 10 μM;

e) ROS 探针装载:去除处理药物,用无血清培养液洗涤细胞1-2次,加入适当体积稀释好的DCFH-DA 工作液。需充分盖住细胞,例如:6孔板通常不少于1 mL/孔, 96 孔板通常不少于100 μL/孔, 37℃细胞培养箱内避光孵育30 min;

f) 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1-2次,以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA;

2、收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

a) 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态良好。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞;

b) 药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于 37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间可根据药物特性和细胞类型决定;

c) (选做)阳性对照:先用无血清培养基稀释阳性对照(H2O2, 100 mM)到常用工作浓度 100 μM,加入细胞,37℃避光孵育 30 min-4 h 以提高活性氧水平,不同细胞类型存在差异。例如:HeLa 细胞需孵育 30-60 min;

d) ROS 探针准备:探针装载前,用无血清培养液稀释 DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。

e) 探针装载:离心收集细胞去除处理药物,并用无血清培养液洗涤细胞1-2次,离心收集细胞,加入稀释好的探针,使其细胞密度为0× 106 - 2.0× 107

注意:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法以及检测总量来进行调整。例如:对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106

f) 细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞 1-2 次,以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。

3. 荧光显微拍照

a) 对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞,取25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片;

b) 荧光显微镜下,选用 FITC 滤光片观察荧光,去除背景观察荧光的变化。

4. 流式细胞分析操作方法

a) 对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对悬浮生长细胞,直接收集细胞。用 5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5-1 x 105/ml);

b) 流式细胞仪中,488 nm为激发波长,525 nm为发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

注意事项:

  • 阳性对照H2O2一般使用浓度为100 μM (推荐浓度50-200 μM,具体依细胞类型而定) 。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果荧光信号过强,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
  • 实验过程中,如果阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1:2000-1:5000 稀释荧光探针DCFH-DA,使DCFH-DA的终浓度为 2-5 μM。探针装载的时间可在15-60 min 内适当进行调整,尽量缩短读片时的曝光时间,并且试验组、对照组曝光时间需保持一致。
  • 活性氧阳性对照 (H2O2) 仅仅用于作为阳性对照的样品,并非所有试验组样品中都需加入活性氧阳性对照。
  • 探针装载后,一定要洗净未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
  • 尽量缩短探针装载后到检测所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。

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