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拿什么来拯救你,我的重组蛋白

发布时间:2021年04月21日 浏览次数:240

重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构,以及筛选靶向药物的有力工具,在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用,常用的表达系统主要包括原核、真核表达系统。那不知道大家在进行重组蛋白表达时会不会纠结这样的问题:该选择什么表达系统,蛋白产量怎么才能有所提高。接下来小编带你了解一些常见的外源基因表达系统(包括原核、真核表达系统)以及一些提高蛋白产量的方法,分钟间,拯救你的重组蛋白。

一、重组蛋白表达系统

原核细胞表达系统具有细胞生长增殖快,蛋白产量高,操作简单,成本低等特点,是目前生产重组蛋白药物使用最为广泛的表达系统。但原核细胞中缺乏对真核蛋白进行翻译后修饰如蛋白糖基化和磷酸化的机制,也没有适合的分子伴侣不能对蛋白进行正确的折叠,而这些对于真核蛋白行使功能是必须的,这就导致原核表达系统的蛋白产物与天然蛋白差别很大,作为药物很可能会引起人的免疫反应,而且产物常常是无活性的或是活性很低。

真核表达系统主要包括酵母表达系统,昆虫/杆状病毒表达系统,哺乳动物细胞表达系统。

酵母表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工能力,有利于真核蛋白的表达,特有的 AOX 强效启动子使得外源基因表达量很高,而且酵母的培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,非常适合大规模工业化生产,另外用甲醇代替 IPTG 作为诱导物,部分甲醇酵母以甲醇等工业产物代替葡萄糖作为碳源,生产成本非常低。但是酵母在表达外源基因时会造成产物蛋白的不均一、降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。

杆状病毒做为外源基因表达的宿主,由于其可以对真核蛋白进行翻译后加工等过程而被广泛地用于真核基因的体外表达。虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰,但这种修饰存在着一定的限度; 虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样,但寡糖链的性质有所不同,无法产生复杂的糖基侧链,这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。

哺乳动物细胞自身具备蛋白折叠和翻译后修饰的功能,其表达的重组蛋白在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子,更有可能获得与天然分子相同的生物活性。哺乳动物细胞表达体系分为稳定表达系统和瞬时表达系统。其中瞬时表达可以在较短时间内,以高效率、低投入获得所要的药物蛋白或未知蛋白的功能,因此其作为一种快速、便捷的蛋白表达方法而受到人们的青睐。

表达系统 哺乳动物表达系统 原核表达系统 酵母表达系统 昆虫表达系统
优点 最高水准的正确的翻译后修饰

最大概率获得具有完全功能的人源蛋白质

 

可扩展

低成本

培养条件简单

 

真核蛋白处理过程

可扩大至发酵规模(每升数克级)

简单的培养基要求

与哺乳动物系统相似的翻译后修饰

相比哺乳动物系统更高的得率

缺点 周期长,要求更苛刻的培养条件

 

容易形成包涵体

最少的翻译后修饰可能较难表达功能性哺乳动物蛋白

对于极高的得率需求需要进行发酵实验

生长条件需要进行优化

 

要求更高的培养条件

二、提高蛋白产量的方法

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率可以从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质、高密度发酵等方面着手。

合适的启动子应当具有以下三个特征:

①能够实现目的基因的高效表达 (通常使目的蛋白占菌体总蛋白质的 10%-50% ) ;

②减少本底表达,防止本底表达的目的蛋白对宿主对数生长期造成负面影响;

③诱导方法简单、经济。

SD序列可以减少 mRNA 形成,能够降低翻译效率,因此对形成翻译起始复合物,有效地进行蛋白质翻译是必需的。另一种提高可溶性蛋白表达的策略为信号肽优化,大肠杆菌周质空间中蛋白质的种类少、数量低,且蛋白酶含量也较低,因此目的蛋白在周质空间中的表达有利于分离纯化和减少蛋白酶的降解。目的蛋白被转运至周质空间过程中信号肽被酶切,且氧化性的周质空间有助于目的蛋白的正确折叠与正确构象的维持。具有不同特性的工程菌对重组蛋白的可溶性表达具有重要意义,目前已有多种商品化的大肠杆菌株能够协助重组蛋白的可溶性表达。

哺乳动物表达系统主要通过调节影响细胞生长的参数(比如pH、C02浓度、离子强度和细胞密度,培养基等)和利用基因工程的方法(通过在表达载体上插入强启动子或增强子来增加转录水平)提高蛋白表达量。降温也是常用的提CHO表达系统蛋白产量的方法,从常规37℃培养,到转染后降低至30 ~ 32℃。降低温度可以使细胞停留在G1期,降低代谢速率,同时提高蛋白产量。加入化学复合物是一种常用的提高转染效率的方法。最常用的是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDCA) 抑制剂,通过解除转录抑制来提高重组蛋白表达量。一般在转染后4 h 加入,此时DNA已进入细胞核内,转录刚刚开始。最常用的HDCA抑制剂是丙戊酸和丁酸钠。

除了对启动子、增强子、外源基因编码序列和多聚腺苷酸序列进行优化外,信号肽的筛选也是提高蛋白表达的重要策略之一。有研究表明通过在载体上添加 CD5L 引导肽序列,使得重组蛋白在哺乳动物细胞中得到很好的表达。人IL-2信号肽和人白蛋白信号肽在哺乳动物细胞表达系统中分泌效率比较高,此外来自Gaussia的荧光素酶(GLuc)信号肽能高效表达碱性磷酸酶,也可以作为一种理想的引导蛋白分泌表达的信号肽。

三、相关产品推荐

货号 名称 规格
PRP1114 Mouse RANKL protein 2µg/10µg/100µg /1mg
PRP1211 Rat EGF protein 20µg /100µg/500µg /1mg
PRP1022 Human IL-8 protein 10µg/50µg/100µg /1mg
PRP1023 Human IL-18 protein 10µg/50µg/100µg /1mg
PRP1214 Rat IFN-gamma protein 20µg/100µg/500µg /1mg
PRP1024 Human TGF-alpha protein 20µg/100µg/500µg /1mg
PRP2041 Human Transferrin protein 10µg/50µg/100µg /1mg
PRP2017 Human IL-4 protein 10µg/50µg/100µg /1mg
PRP2116 Mouse GM-CSF protein 20µg/50µg/100µg /1mg

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