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重组蛋白溶解常见问题

发布时间:2021年01月07日 浏览次数:481

冻干粉正确溶解的方法步骤:

第1步:开盖之前一定要离心。

冻干粉在运输过程中,会因为外力的因素粘附于管壁或者管盖上面,在开盖之前,先通过离心操作,将冻干粉收集于管底,避免损失很浪费。快速离心10000-12000 rpm,30 s;若没有高速离心机,3000-3500 rpm,5 min。

 

第2步:离心之后,向冻干粉中加入提供的复溶buffer,用枪头轻轻吹打混匀,重悬至浓度不低于100 μg/mL。(比如规格为100 μg的重组蛋白,对应加入1 mL的复溶buffer溶解)。

A:溶解之前,一定要按照说明书上的提示,使用提供的复溶buffer重悬冻干粉。

重悬溶液的PH值和离子强度对于重组蛋白的溶解性好坏有很重要的影响;如果使用的buffer不合适,很可能产生冻干粉不能完全溶解或者根本无法溶解的现象产生,最终导致溶解之后的细胞因子或者重组蛋白活性不够或者丧失。

B:溶解之前,一定要按照说明书上的提示,溶解到指定的浓度。

按照说明书上的提示,将冻干粉稀释到指定的浓度范围,有利于维持细胞因子或者重组蛋白良好的稳定性。如果高于或者低于指定的浓度范围,一方面可能会造成细胞因子或重组蛋白的活性下降;另一方面,蛋白可能会出现聚集、导致部分蛋白未溶解,活性减弱;最后,高于指定的浓度范围,可能会超过蛋白的最大溶解度,导致蛋白无法完全溶解。

 

第3步:用复溶buffer直接溶解的细胞因子或重组蛋白液体可在2-8℃最长保存1周。

对于周期较短的实验(不超过7天),可以直接取该条件下保存的细胞因子或者重组蛋白溶液加入到培养体系内即可,待一周之内用完;如果实验条件设置的使用浓度低于复溶之后的溶液浓度,请用含载体蛋白进行稀释,如果稀释液不含载体蛋白,容易导致细胞因子或者重组蛋白粘附在管壁或者瓶壁上,使其在溶液中的浓度下降,进一步导致细胞因子或者重组蛋白的活性减弱。

 

第4步:若要长期保存,则需用含载体蛋白(0.1%的BSA或HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存与-20℃至-80℃。

注意:用提供的复溶buffer溶解的冻干粉,不可直接冻存于-20℃至-80℃。因为塑料管壁对蛋白有很好的吸附作用,会导致细胞因子或者重组蛋白粘附在管壁不易分离,进而导致溶液中细胞因子或者重组蛋白的实际浓度偏低,最终导致其活性下降。而载体蛋白可以预先封闭塑料管壁上蛋白结合位点,使细胞因子或者重组蛋白不会粘附于管壁。因此长期保存,在分装冻存前,一定要用含载体蛋白的溶液进一步稀释,稀释后的浓度可为任意浓度,因大量的载体蛋白可以保证低浓度的细胞因子或者重组蛋白仍然维持较高的稳定性。

 

常见问题:

1:能否用涡旋震荡仪帮助冻干粉充分溶解?

溶解过程中,不可用涡旋震荡仪快速震荡,否则会影响细胞因子的活性。建议用枪头轻轻吹打混匀或者上下轻轻颠倒混匀即可。

 

2:按照正常方法步骤操作,溶解过程中出现无法完全溶解的现象怎么办?

一般情况下,冻干粉都是非常容易溶解的,用枪头轻轻吹打混匀或者上下颠倒混匀,即可实现冻干粉的完全溶解。对于不易溶解的冻干粉,可以将加入复溶buffer的冻干粉放在水平摇床上低速摇一段时间;或者将重悬液在4℃静置2小时以上等措施来帮助其完全溶解。

 

3:能否用PBS或者培养液DMEM溶解冻干粉?

优先推荐使用产品提供的复溶buffer。不同的细胞因子,对应溶解液的成份不完全相同,需要根据具体情况判断是否可以用PBS或者培养基DMEM,一般情况下,如果某些冻干粉推荐的溶解液不是PBS,一定不能用PBS来溶解,否则会对细胞因子或者重组蛋白的活性造成影响。如果推荐的溶液为成份为1XPBS,则可以使用PBS来进行溶解。

 

4:稀释用的含载体蛋白的溶液指什么溶液?用水可以么?

不可以用水。该溶液指的是指有一定缓冲能力、PH值为中性,如PBS,培养液DMEM或者RPMI1640等。

 

5:做无血清培养,或者动物体内实验时,细胞因子不能含有BSA或者HAS,要想长期保存细胞因子或者重组蛋白怎么办?

订购小包装,每次使用一支,短期内用完。另外一种方法是,用含海藻糖的溶液来稀释重悬的细胞因子或者重组蛋白,然后分装冻存。

 

6:细胞因子的活性单位值如何计算?

活性单位值的计算需要根据具体指标的半数有效浓度及ED50值(可诱导50%最大反应的细胞因子浓度)来计算。1个ED50就相当于1个uint。举个例子,如果某个细胞因子指标的ED50位2 ng/mL,对应1个unit就是2 ng/mL,那么1mg该指标含有的活性单位unit可为:units=1 mg/(2.0 ng/mL)=5*105

如果文献中要求该指标的工作浓度是100 units/mL,那么加入到培养体系中的ng数是多少了?通过前面的计算,1 mg里面还有5*105个units,则1 unit为2 ng;100 units即为200 ng,也就是在培养体系中加入200 ng/mL即可。

 

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