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为什么称TdT末端转移酶为别具一格的DNA聚合酶?

发布时间:2021年06月08日 浏览次数:695

DNA聚合酶在核酸的复制,修复和重组中起着至关重要的作用。克隆技术,基因工程,生物芯片技术等都需要DNA聚合酶的参与。一般来讲,聚合酶都使用DNA(或反转录的情况下为RNA)模板扩展引物,以指导每个掺入事件。然而,有一种独特的DNA聚合酶称为末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT),仅使用单链DNA即可进行DNA合成。

TdT是DNA聚合酶X家族的成员,最早是从小牛胸腺细胞裂解物中纯化出来的,随着研究深入,已经在人和牛中观测到了TdT的三个亚型:分别称为TdTS,TdTL1和TdTL2。它们都具有不依赖模板将核苷酸添加到可用的3'-OH末端的活性。TdT独特的从头创造基因组材料的能力使其成为自然界中最引人入胜的DNA聚合酶之一。那么这种非模板依赖性的DNA聚合酶会给我们的研究带来什么变化呢?

在1992年,Gorczyca等人就通过TdT和流式细胞术来分析细胞凋亡,这就是我们现在的TUNEL分析。细胞在发生凋亡时, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。TUNEL是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

TdT标记细胞凋亡

TdT标记细胞凋亡

其次,TdT可以在cDNA末端的快速扩增中也有重大作用。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3'端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进,包括:

  • 利用锁定引物合成第一链cDNA;
  • 使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在5'端加poly(C)尾;
  • 采用耐高温的逆转录酶;
  • 采用热启动PCR 和降落PCR提高PCR反应的特异性。

现在的RACE主要有3'RACE和5'RACE,分别用于cDNA3'端和5'端的扩增。其中5'RACE在使用基因特异性引物(GSP)与mRNA结合,并且逆转录生成特定的单链cDNA后,就需要使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)添加相同的字符串cDNA的3'端的核苷酸,称为均聚物尾巴。其中TdT的非模板依赖性至关重要,可以催化在单链DNA的3'羟基端加上dNTP,当只有dCTP时,只在3'端添加C,形成Poly(C)尾。然后进行PCR扩增获得cDNA5'序列。虽然某些逆转录酶本身可以在3'端添加C,但是添加的C数量非常有限,不足以使下一步的高效结合,因此使用TdT是解决该问题的有效方法。

5'RACE中TdT的作用

5'RACE中TdT的作用

近年来,TdT作为抗癌靶点的研究进展迅速。临床研究发现,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在B、T细胞分化最早期的阶段(原始胸腺细胞、幼稚胸腺细胞、普通胸腺细胞和B系祖细胞)就开始表达,而且对相关癌症的发生、发展和反应中起着重要的作用。急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病,其特征是大量未成熟淋巴细胞的发育。在ALL的恶性淋巴母细胞中,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在细胞表面显示出不同水平的表达以及表达出多种亚型。TdT在细胞表面的不同表达可以帮助区分恶性淋巴细胞和反应性淋巴细胞。此外,ALL患者一般用化学药物减少病变白细胞数量的方法来治疗。TdT在白细胞表面的表达水平对判断预后及指导治疗有一定价值。

人的骨髓抽吸涂片,紫色大细胞是淋巴母细胞

人的骨髓抽吸涂片,紫色大细胞是淋巴母细胞

迄今为止,TdT的许多生物学作用尚未完全揭示。由于TdT的聚合活性不依赖模板链,因此有关核苷酸结合和选择的分子细节仍然难以捉摸。未来的生化和基于细胞的研究无疑将使人们对这种迷人而神秘的DNA聚合酶有更多的了解。

 

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