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Abbkine带你了解细胞凋亡检测!

发布时间:2021年11月11日 浏览次数:240

细胞凋亡:细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下自体损伤的一种现象,而是为更好的适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的常用方法

检测方法 举例
膜联蛋白 V 检测 Annexin V/PI 双染
线粒体膜电位依赖性染料 JC-1
DNA 固缩与片段化 TUNEL检测
活性 caspase 检测 Caspase 3
细胞色素 C 释放 cytochrome c

其中,最常用的方法为:

1.膜联蛋白 V 检测:Annexin V/PI 双染

在正常细胞中,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)位于胞浆侧。细胞凋亡中期,PS外翻。Annexin V是一种Ca2+依赖的对PS具有高度亲和力的磷脂结合蛋白,因此可以用荧光标记的Annexin V检测PS的外翻。凋亡末期,细胞膜结构受损,原本不透膜的核酸染料(如PI、7-AAD等)也能进入细胞,从而产生信号。

Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡实验步骤与常见问题分析:

a.各象限代表的细胞状态问题

  • Q1:(AnnexinV-染料)-/PI+,此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中,甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多,实验结果越不可信,建议实验中尽量控制这一象限细胞比例;
  • Q2:(AnnexinV+染料)+/PI+,此区域的细胞为晚期凋亡细胞;
  • Q3:(AnnexinV-染料)+/PI-,此区域的细胞为早期凋亡细胞;
  • Q4:(AnnexinV-染料)-/PI-,此区域的细胞为活细胞。

b.假阳性

对贴壁细胞而言,消化是最关键的步骤,消化液需用不含 EDTA 的胰酶,因为 Annexin V 和 PS 的结合需要 Ca2+,而 EDTA 是 Ca2+ 螯合剂,使用含有 EDTA 的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长,吹打细胞要轻柔,因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤,造成假阳性。

神经细胞膜容易破坏外翻,导致假阳性,所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。

c.染色前或染色后的细胞可不可以固定?

固定会破坏细胞的完整性,使PI透过细胞膜进入细胞,提高细胞的凋亡百分率。所以,染色前和染色后的细胞都不可以固定,并且染色后的细胞需要在1小时内上流式检测。

2.Tunel法检测

细胞凋亡中,染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和荧光素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有 3'-OH 形成,很少能够被染色。由此,TUNEL 成为了检测 DNA 片段化(细胞凋亡)的最常用方法。

TUNEL法检测细胞凋亡常见问题及解决方案:

a.阳性组、阴性组和实验组怎么设置

阳性组:用DNase酶处理,诱导细胞凋亡、暴露出3‘-OH末端。每次实验做一个即可;

阴性组:不加TdT酶,其余操作和实验组相同

实验组:除了阳性组和阴性组,所有的样本均是实验组。

b.荧光信号弱或没有荧光信号

①样本处理不当

  • 样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点,便于染色;
  • 脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min,再使用二甲苯两次5-10 min;而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗;
  • Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间,常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min,30μm左右的片子孵育30 min;
  • Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL;
  • 放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜,减低染色效率。建议使用新鲜切片。

②染色操作不当

  • 染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色;
  • TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度;
  • TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导致TdT酶失活;
  • 样本干燥。加上TUNEL反应液后,请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行,保证样本均匀染色,又可防止反应液干燥。

③荧光检测操作不当

  • 操作未避光。由于荧光易碎灭,建议标记与检测样本时,载玻片要避光,观察时要尽量快。

c.荧光背景强

①染色操作不当

  • TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当,一般是 37 ºC 孵育60 min,避免串色;
  • TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数,优化浓度;
  • PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次,来避免切片样本中残留的染料。

②荧光检测操作不当

  • 曝光时间过长。建议调整曝光条件,先对阴性组调整到无背景光,然后用这个曝光条件去拍摄实验组(可以微调,但是不需要大调)。

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