加入收藏 欢迎光临Abbkine Scientific Co., Ltd官方网站
登录 注册
中文
0

购物车

¥0

细胞凋亡检测知多少,Annexin V/PI加Tunel最精确

发布时间:2021年03月11日 浏览次数:949

Apoptosis,细胞凋亡,由Kerr1972年首次提出,是指细胞在一定的生理或病理条件下发生,受基因严密调控的细胞自主且有序的死亡,又称程序性细胞死亡。在多细胞生物的生长、发育、存活以及死亡等过程中都伴随着细胞凋亡的过程。细胞凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如阿尔茨海默症、帕金森症、肿瘤等。研究表明,多种肿瘤细胞具有响应较低刺激而引发凋亡的能力,因此,诱导癌变细胞凋亡是探索的方法之一,开发有效的细胞凋亡诱导剂将会是治疗癌症的良策。通过对比细胞凋亡的不同检测方法各有优劣,综合待检测样本类型、实验目的及需求、检测结果准确度等因素,本文将着重介绍常用且灵敏度较高的Annexin V-AbFluor488/PI检测方法及TUNEL法。

一、什么是细胞凋亡?

Apoptosis,细胞凋亡,由Kerr在1972年首次提出,是指细胞在一定的生理或病理条件下发生,受基因严密调控的细胞自主且有序的死亡,又称程序性细胞死亡。在多细胞生物的生长、发育、存活以及死亡等过程中都伴随着细胞凋亡的过程。

细胞凋亡

性质

生理性/病理性,特异性

诱导条件

非随机发生,轻微刺激

生化特点 主动过程,有新蛋白合成
形态变化 细胞膜、细胞器相对完整,细胞核固缩
DNA检测 DNA片段化,电泳呈梯状条带
炎症反应 溶酶体相对完整,局部无炎症反应
凋亡小体 出现凋亡小体
基因调控 受基因调控

形态学特征,从左至右依次是细胞核核缩、核溶、核碎:

Morphological characteristics of apoptosis

形态学特征,从左至右依次是细胞核核缩、核溶、核碎

二、细胞凋亡检测方法有哪些?

细胞凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如阿尔茨海默症、帕金森症、肿瘤等。研究表明,多种肿瘤细胞具有响应较低刺激而引发凋亡的能力,因此,诱导癌变细胞凋亡是探索癌症治疗的方法之一,开发有效的细胞凋亡诱导剂将会是治疗癌症的良策。许多抗癌药通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症。那么检测细胞凋亡的方法有哪些,各自有哪些优缺点呢?

分类 检测方法 优缺点
 

 

形态学检测

细胞器亚显微结构观察,电镜 凋亡检测金标准。

无法定量;实验步骤繁琐;

细胞核染色、镜检

(Hoechst 33342)

成本低、操作方便、可定量。

需对细胞进行计数。

 

 

细胞功能检测

线粒体膜电位检测

JC-1,MitoTracker

适合成像检测,染色结果只能用来判断线粒体膜电位是否丢失,不能定量。
细胞膜表面磷脂酰丝氨酸检测

Annexin V-AbFluor™ 488/PI

最受欢迎的细胞凋亡检测方法。

需制备单细胞悬液,可对凋亡不同时期比例进行定量。

 

 

生化标记检测法

凋亡分子标记检测

Caspase的活性检测

Caspase含量检测(WB)

 

能够进行高通量筛选。

可定量。

DNA损伤检测

DNA电泳

TUNEL法

 

电泳检测耗时,无法定量,稳定性差。

适合用于组织切片样本的凋亡研究。

三、精准细胞凋亡检测的组合检测方法

通过对比细胞凋亡的不同检测方法各有优劣,综合待检测样本类型、实验目的及需求、检测结果准确度等因素着重介绍常用且灵敏度较高的Annexin V-AbFluor 488/PI检测方法及TUNEL法。

(一)Annexin V-AbFluor 488/PI检测方法

在正常活细胞中,磷脂酰丝氨酸PS位于细胞膜的内侧,而在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种钙离子依赖型磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合,通过荧光素标记Annexin V即可简单快速地直接检测出细胞早期凋亡情况。

碘化丙啶PI是一种不能透过完整的细胞膜的核酸染料,早期凋亡的细胞保持有完整细胞膜,但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能透过细胞膜对细胞膜进行染色。

将Annexin V-AbFluor 488(绿色荧光)与PI(红色荧光)配合使用,可以准确的区分开凋亡早期、凋亡晚期及死细胞。

对于这种方法样本处理、染色操作及荧光的拍照决定了凋亡检测的精准度,对于不用样本及不同的检测方法,建议按照如下宝贵经验进行:

A、荧光拍照关键

1、悬浮细胞或重悬液制片拍照

将细胞用少量PBS或重悬液将细胞重悬成细胞浓缩液,吸取5-10ul在洁净的防脱载玻片上进行画圈涂片,盖上盖玻片立刻在显微镜下立即进行镜检。处理过程中注意速度,防止细胞死掉,重悬密度不易过小,进行涂片时以小于10ul的细胞悬液体积最适,整个操作建议在10min内完成。

2、细胞培养小皿或爬片拍照

皿底留有少量缓冲液,避免干片。拍照前一定先轻柔清洗,防止因清洗不充分导致拍照过程中有非特异性背景。

Hela cells were induced by camptothecin for 24 hours and stained with Annexin V-AbFluor 488 apoptosis detection kit (KTA0002).

如上结果图:用喜树碱诱导Hela细胞24小时,用Annexin V-AbFluor 488凋亡检测试剂盒(KTA0002)进行染色。能被Annexin V- AbFluor 488/PI染色(绿色膜和红色碎片核)是早期凋亡细胞、坏死或晚期凋亡细胞。

B、流式实验关键步骤

1、消化细胞时避免假阳性

为防止假阳性的产生,消化细胞建议使用无EDTA的胰酶。

2、设置对照组

在流式细胞术中所测得的量是相对值,而非绝对值。如需知道绝对值则必

设置对照组,对照组包括有阴性对照和阳性对照。上机检测时建议设置空白组,Annexin V-AbFluor 488/PI单染组对照组,另需要提前调试好流式细胞仪。

3、检测的细胞量要适中

建议准备足量细胞,一般建议1×106 个细胞,如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数,结果不准确,如细胞量太多加入的抗体或染料相对不足,结果也受影响。

Hela cells were induced by camptothecin for 24 hours, and were detected by Annexin V- AbFluor 488 apoptosis detection kit (KTA0002, Abbkine).

如上结果图:喜树碱诱导Hela细胞24小时,用Annexin V- AbFluor 488凋亡检测试剂盒(KTA0002,Abbkine)进行检测。使用Annexin V-AbFluor 488和碘化丙啶PI可以区分早期凋亡细胞(Annexin V- AbFluor™ 488阳性)、晚期凋亡或坏死细胞(Annexin V- AbFluor™ 488和碘化丙啶阳性)。

(二)TUNEL检测方法

TUNEL是检测细胞凋亡中DNA片段化的最常用方法。在细胞凋亡中染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT) 的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,也没有3’-OH形成,很少能够被染色。

A、组织TUNEL实验中关键步骤

1、充分脱蜡和水化 <TIPS>

脱蜡前切片可以先在65℃烤箱中烘烤30min,再使用二甲苯进行脱蜡10-20min,而水化则用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗5min。

2、把握好细胞通透的时间 <TIPS>

根据切片的厚薄选择蛋白酶k的孵育时间,蛋白酶K使用浓度不得低于

20 μg/mL,常用37℃处理10-30 min,6um切片时间稍短,20um切片增长时间,通过摸索达到既不脱片又能够使后面的酶和抗体进入胞内。处理时间过长易脱片、过短达不到通透效果。

3、适当延长TUNEL反应液时间 <TIPS>

建议处理条件是37℃反应2 h,可以根据预估的凋亡损伤程度选择更长的时间,建议结合最终的背景着色进行判断。

4、PBS的充分清洗 <TIPS>

在TUNEL反应后的清洗应十分严格,建议使用PBST重复清洗后再换PBS彻底清洗,或者增加PBS洗涤次数,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

Paraffin section of mouse intestinal tissue showed that red fluorescence showed late apoptosis cells.

如上示例图:小鼠肠道组织石蜡切片,200倍放大,红色荧光为发生晚期凋亡的细胞。

使用试剂:KTA2011 TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒 (橙色荧光)、DAPI

操作步骤流程图:

Operation flow chart of TUNEL detection:

B、细胞TUNEL实验中关键步骤

1、加药模型的判断处理 <TIPS>

细胞样本做TUNEL时一定需要确认模型是否成功,在白光的镜检时需能明显判断凋亡的细胞。

2、蛋白酶k的使用<TIPS>

蛋白酶K目的是通透细胞膜和核膜,从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应,提高阳性率。浓度过高或孵育时间太长非常容易使细胞脱落,建议使用20 μg/mL的蛋白酶K(0.5% Triton X-100),反应时间建议为5-15 min。

注意:关键试剂蛋白酶K一定需要摸索出最适合的使用条件。如温度过高,反应时间过长,易破坏核酸结构,出现假阳性。

 四、细胞凋亡检测总结

综合细胞凋亡检测的实验操作要点,一定要注意:

  • 样本制备:根据不同的细胞反应体系或组织反应体系,严格制备对应样本。
  • 蛋白酶K:蛋白酶K的反应时间及使用浓度一定需要进行预实验,确定最适条件。
  • 反应液体系:根据不同样本类型需进行预实验确定Annexin V- AbFluor 488/PI(Tunel)反应液最适使用条件。
  • 防淬灭处理:一定要使用高效抗荧光淬灭剂进行处理。
  • 结果检测:根据不同检测方法选择最适检测仪器。例培养皿/爬片检测Annexin V-AbFluor 488/PI建议使用共聚焦显微镜或倒置荧光显微镜

五、相关产品

货号 名称 样本类型 检测仪器
KTA0001 Annexin V-AbFluor™ 408细胞凋亡检测试剂盒 活细胞  

倒置荧光显微镜

正置荧光显微镜(细胞涂片)

激光共聚焦显微镜

细胞流式仪

 

KTA0002 Annexin V-AbFluor™ 488细胞凋亡检测试剂盒 活细胞
KTA0003 Annexin V-AbFluor™ 555细胞凋亡检测试剂盒 活细胞
KTA0004 Annexin V-AbFluor™ 647细胞凋亡检测试剂盒 活细胞
KTA2010 TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒 (绿色荧光) 活细胞、

固定细胞、组织

正置荧光显微镜

激光共聚焦

KTA2011 TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒 (橙色荧光)
BMD00062 Hoechst 33342 细胞、

组织

荧光显微镜

细胞流式仪

激光共聚焦

BMD00063 DAPI

 

Abbkine以特色的蛋白质检生产与测试剂起家,致力于创新和研发各类抗体、生化试剂、蛋白质和实验试剂盒,以期望为全球科研工作者提供革新的解决方案。我们很自豪地为客户提供如下特色产品线,并会一如既往地开发新型的、高品质的、买得起的生命科学研究和诊断试剂产品。 企业使命:激发我们内在的创造力,提供有竞争力的生物医学产品和服务,持续为客户创造最大价值 亚科因生物定位:服务于细胞和蛋白研究全球用户,以应用流程和产品组合的方式为用户提供经济型和技术型的产品解决方案。

 

意见反馈
在线咨询
扫码关注

微信公众号

返回顶部