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使用TUNEL法进行细胞凋亡检测的注意事项

发布时间:2021年03月16日 浏览次数:330

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, Tunel)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。由此,Tunel成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。然而,在我们进行实验时,有时候能够确定是根据实验说明书一步一步操作的,但得到的结果却不符我们的预期,出现各种各样的情况。比如:明明是阴性对照,却也出现了荧光显色;或者是在显微镜下观察时,背景色很深,难以观察或难以拍到一个清晰的结果图;又或者是加药处理后,能够观察到细胞形态发生皱缩变圆甚至部分细胞漂浮,但最后的荧光镜检结果却只能看到很少的荧光等等。虽然Tunel实验的步骤简单明了,但其中值得关注的细节真的不少。

TUNEL Apoptosis Detection-Unsuccessful dyeing

图1 未成功染色

注:未观察到荧光而调高曝光时间与增强系数,出现了由于光线照射而显示出了细胞的完整形态的背景

TUNEL Apoptosis Detection-Unsuccessful dyeing

图2 未成功染色

注:荧光出现在了细胞膜上而未出现在细胞核上

TUNEL Apoptosis Detection-Unsuccessful dyeing

图3 组织切片自发荧光

注:未染色时能够在显微镜下观察到荧光

一、固定:作为我们Tunel实验的第一项步骤,固定是非常关键的一步,能够影响我们对最终实验结果的观察判断。

  1. 在选择固定液时,我们建议使用4%的多聚甲醛(PBS)进行固定,不建议选用乙醇和甲醇,也不能选用甲醛替代,因为市面上购买得到的甲醛大多含有甲醇。这会使我们后续的染色过程中标记效率降低,难以观察到荧光。
  2. 固定液的浓度不可过高,浓度过高的固定液会使组织边缘迅速固定,影响液体的穿透,影响固定效果,导致组织中心的细胞自溶、DNA链不规则断裂等情况的发生,实验结果出现假阳性。
  3. 固定时间也不可过长,太长的固定时间会影响试剂的染色效率。
  4. 在一些细胞或组织中,核酸酶或聚合酶活性水平较高,会导致我们实验结果出现非特异性荧光,这就要求我们在进行固定步骤时的动作要快,在取得我们的实验组织或细胞后要立即进行固定来避免出现酶导致的假阳性。

二、孵育:实验结果出现的假阳性也可能与Tunel染色孵育步骤有关。

Tunel染色液孵育时间过长,可能会出现非特异性荧光。Tunel染色液发成蒸发渗漏等情况导致细胞或组织表面在孵育过程中不能保持湿润也会使实验最终结果出现假阳性。这就需要我们保证Tunel染色孵育过程中样品能充分接触染色液并控制孵育时间。

三、若实验结果的背景荧光很高,我们优先建议对支原体污染的情况排查,可以使用相关支原体染色检测试剂盒进行检测。

当然,当细胞处于高速分裂和增殖状态中时,有时也会出现细胞核中的DNA断裂,对结果造成影响。在进行组织切片的染色时,有时我们发现即使还未进行染色步骤,然仍然能在显微镜下观察到荧光,这是由于红细胞中的血红蛋白存在自发性荧光,误导实验结果,对此建议选择其他的细胞凋亡检测法进行检测。

四、避光操作

一般而言,荧光在普通光照下不能长时间保持荧光,所以,在进行需要避光操作的步骤时,我们要严格进行避光操作,避免荧光淬灭导致不能对实验结果有准确判断。

五、小心轻柔操作

贴壁细胞在加药诱导凋亡后,细胞状态会发生改变,细胞形态皱缩边缘,其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时,需要小心操作,避免吹打造成的细胞脱落,尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。

Positive treatment of Hela cells with dnase

图4 DNA酶做Hela细胞阳性处理

六、注意曝光时间

在进行荧光显微镜观察时,根据显微镜的不同,具体参数曝光时间建议在1000ms以内,增益参数建议在500%以内,或不开增益曝光时间控制再2000ms以内,过度曝光也会增加实验的假阳性。

Tunel的参考结果大致为细胞核内有明亮荧光信号,若整体荧光信号强度弱,最终拍摄照片没有发现有明显的亮点而模糊一片,我们也可以认为不是合格的凋亡染色。建议最终荧光照片与明场照片做对比来初步判定结果是否为背景光照。根据不同的细胞、组织,具体的实验细节都需要不断摸索。祝愿广大科研工作者实验顺利。

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