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EdU细胞增殖检测法——药物抑制癌细胞增殖检测的明智之选

发布时间:2021年03月11日 浏览次数:465

对于哺乳动物和人类而言,自然情况下,其以细胞增殖的方式产生新的细胞补充体内衰老和死亡的细胞,以保证机体和器官的正常新陈代谢,这一切都是在遗传物质DNA的控制下有序的进行。但是当机体或者某个器官部位发生病变,正常的细胞增殖可能发生异常的变化,比如当发生肿瘤、癌症等疾病的时候,正常的细胞增殖变得无序,发生不正常的增殖变化从而导致病灶的发生。为了寻找治疗这种变化的药物,我们会开发多种药物进行体外实验,以验证药物抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖,从而评估药物潜在的治疗效果。同时,细胞增殖的能力也是评价细胞、代谢、生理、病理状况、细胞活性、基因毒性等的重要指标之一。细胞增殖虽然与多种因素有关,比如细胞代谢活性、与细胞增殖相关的蛋白表达、ATP的浓度等,但是检测细胞增殖现象的最直接最准确的方法就是用荧光探针直接检测遗传物质DNA的合成,这种方法是研究细胞增殖、信号通路、DNA修复及分化等方向常用的方法。

The role of cell proliferation

目前,基于DNA的合成原理,人们最初开发了工具是BrdU染色法, 但是这种方法操作耗时长,往往需要过夜处理细胞,操作繁杂,比如需要DNA变性、抗原修复以及抗原抗体反应等操作,后来在BrdU的基础上,人们开发出了革命性的探针--EdU,这种方法不需要繁杂的操作,节约时间,且反应更灵敏和准确。并且与MTT/WST-1或者CCK-8这种依靠化学显色法只能得到一个折线图的方法相比,EdU 细胞增殖检测法可以得到高清细胞增殖现象数据图,可视化展示数据、更直观、更具视觉效果!

EdU细胞增殖检测法检测人子宫颈鳞癌细胞SiHa细胞增殖

图1. EdU细胞增殖检测法检测人子宫颈鳞癌细胞SiHa细胞增殖(400×),使用Abbkine Edu细胞增殖成像分析试剂盒(货号#KTA2031),橘红色:AbFluor 545 ;蓝色:DAPI)

那么,EdU到底是什么呢?它的检测原理是什么呢?干货来了!

EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷,是一种胸腺嘧啶核苷类似物,其炔羟基团在天然化合物中很少见,在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine) 插入正在复制的DNA分子中, EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488等)通过一价铜离子催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,该反应非常迅速,被称作点击反应(Click reaction),从而可以进行高效快速的检测细胞增殖,特别是可以有效地检测处于S期的细胞百分数。

 

EdU可以说是一款革命性的细胞增殖状态检测方法

与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比, EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

EdU BrdU
检测分子 很小
检测方式 化学反应 免疫反应
DNA变性 不需要 需要
影响其他标记
实验时间 <2小时 过夜
检测敏感度 灵敏 一般

EdU细胞增殖检测法,具体怎么操作呢?请看操作教程:

第一部分: 首先用 EdU 来标记细胞

注意:本实验样本是 Hela 细胞,如果使用其它类型的细胞,实验可能需要做调整。建议 EdU 起始浓度是 10 µM,或者根据细胞类型设置几个梯度预实验摸索最佳EdU浓度,再进行正式实验。

  1. 在六孔板里的盖玻片上培养细胞,使其生长至所需密度后处理细胞;
  2. 用 10 mM EdU 溶液在无血清培养基中制备 2x EdU 工作溶液;
  3. 预热 2x EdU 溶液,然后将 2x EdU 溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中,获得 1x EdU 溶液。例如,对于最终浓度为 10 µM 的溶液,可用 20 µM EdU 的新鲜培养基替换一半含细胞的培养基;

注意:建议不要更换所有的培养基,因为这会影响细胞增殖速率;

  1. 将处理好的细胞孵育12小时;
  2. 孵育完成后立即进行步骤 B;

第二部分:细胞固定和透化

  1. 孵育后除去培养基,并向每个含有盖玻片的孔中加入2.5 mL含多聚甲醛的 PBS,室温下孵育15分钟;
  2. 除去固定液,用2.5 mL PBS洗涤孔中的细胞5分钟,重复三遍;
  3. 除去洗涤液,然后向前五个孔中加入2.5 mL通透液, 室温下孵育20分钟;
  4. 除去通透缓冲液,用2.5 mL PBS洗涤每个孔中的细胞两次,除去洗涤液;
  5. 立即进入步骤 C。

 第三部分: EdU 检测

每孔使用 100 µL 反应混合物。反应混合物体积可根据实际情况进行调节,但必须按比例加入反应组分。

  1. 制备 Click-iT 反应混合物。注意要按表中列出的顺序添加成分,否则反应将无法得到最佳效果。配置好的 Click-iT 反应混合物必须在15分钟内使用。

组分体积

Deionized water               454.8 µL

Reaction buffer (10×)     60 µL

Copper Reagent               24 µL

AbFluor 545 azide          1.2 µL

10× Reducing Agent      60 µL

Total volume                   600 m

  1. 向每个玻片上加入 100 µl Click-iT 反应混合物,室温下避光孵育 30 分钟;
  2. 除去反应混合物,用2.5 mL PBS洗涤每孔一次后,除去洗涤液;

可选择步骤:进行核染色(DAPI 或 Hoechst 33342)或抗体标记;

重要提示:在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色,孵育后请直接进行成像和分析;

「使用Abbkine EdU细胞增殖检测试剂盒发表的文献」:

1.Perilaldehyde activates AMP‐activated protein kinase to suppress the growth of gastric cancer via induction of autophagy

作者:Y Zhang, S Liu, Q Feng       杂志名称:JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY           IF:3.09

2. In vitro mitochondrial-targeted antioxidant peptide induces apoptosis in cancer cells

作者:W Zhan, X Liao, L Li            杂志名称:Onco Targets Therv                                                           IF:2.31

 

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