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经典的细胞凋亡检测常用方法—建议收藏

发布时间:2022年04月15日 浏览次数:634

细胞凋亡(程序性细胞死亡)在细胞形态和细胞生理上都不同于细胞坏死(损伤性细胞死亡)。与坏死细胞不同,凋亡细胞表现出细胞核染色质紧密、细胞质收缩以及产生膜结合的凋亡小体,而且细胞凋亡还可通过基因断裂以及多种细胞蛋白裂解或降解来与细胞坏死区分。细胞凋亡的失调与多种疾病也相关,包括癌症、中风、阿尔茨海默病和多种自身免疫性疾病。细胞的凋亡检测在多种研究领域中都占有重要的地位。面对多种检测凋亡检测方法,到底要如何根据自己的实验方案选择最合适的方法?基于什么原理?小编带您解开疑惑。

凋亡检测方法

一、基于细胞功能(Annexin V法、线粒体膜电位检测)

1、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸检测

磷脂酰丝氨酸在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来(相关产品推荐:KTD104-CN、KTA0002

2、线粒体膜电位检测

细胞凋亡有个典型特征是线粒体活性受损,包括膜电位丧失和线粒体氧化还原能力改变。发生这些的主要原因是线粒体通透性转换孔被打开了,使得离子和小分子可以通过,以及释放了细胞色素C。较常见的方法是通过检测线粒体膜电位确定细胞的凋亡情况(推荐产品货号:KTA4001)。

二、基于生化标记(凋亡分子、DNA损伤)

1、DNA损伤检测

生化标记的方法中,TUNLE法是较常用、较准确的方法。TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端,从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征(相关产品推荐:KTD104-CN、KTA2010)。

2、凋亡分子标记检测

细胞凋亡途径,是由一套明确的信号通路层层调控的。在绝大多数情况下,所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者Caspase-3之上。上游的凋亡信号通过切割Caspase-3,使其具备酶活,并执行最后的凋亡程序。可以通过WB实验、生化检测、IHC等方法确定Caspase的表达量(相关产品推荐:KTA3020KTA3022ABP0135)。

三、基于形态学的方法

1、电子显微镜检查

“凋亡”最早是一个细胞形态学概念。因此,鉴定凋亡的金指标,往往是基于形态学的。尽管电镜检查是鉴定凋亡的金标准,然而其缺点也很明显:无法定量(电镜一个视野仅能观察一两个细胞),实验步骤繁琐;且电镜设备昂贵,不普遍。因此,对于不专门研究凋亡这种细胞现象的实验室来说,基本没有人选择电镜来检测凋亡了。

2、细胞核形态染色

细胞凋亡时染色质浓聚,且细胞核结构在凋亡后期崩解。用荧光染料配合普通的荧光显微镜即可观察到细胞核的状态,以此判断细胞凋亡的情况。Abbkine提供荧光染料BMD0063BMD0062

 

在众多的细胞凋亡检测方法中,最为常用的是Annexin V法和TUNEL法。下面对这两种方法进行详细介绍。

Annexin V双染法

1Annexin V双染法的检测原理

在正常活细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的内侧,而在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(Annexin V) 是一种分子量为35~36KDa的钙离子依赖型磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。通过荧光素或者生物素标记Annexin V即可简单快速地直接检测出细胞早期凋亡情况。碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的,对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

2Annexin V双染法的操作步骤

1)通过所需方法诱导细胞凋亡,同时培养无诱导的对照培养物;

2)4 °C,300 g离心5分钟收集1-2×105细胞,用冰预冷的PBS洗涤两次;

3)用100 μL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞;

4)每100μL细胞悬液中加入4-5 μL Annexin V- AbFlour TM 488 和 1-2 µL PI,轻柔混匀;

5)室温避光孵育15 min;

6)孵育结束后加入 400 µL 1×Annexin V Binding Buffer,轻柔混匀后置于冰上。染色后 30 min 内通过流式细胞仪分析细胞。使用491 nm 和 535 nm 激发,517 nm 和 617 nm 附近测量荧光。

3Annexin V双染法的常见问题

1)不同象限所代表的不同的细胞状态

  • 左上:(AnnexinV-染料)-/PI+,此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中,甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多,实验结果越不可信,建议实验中尽量控制这一象限细胞比例;
  • 右上:(AnnexinV+染料)+/PI+,此区域的细胞为晚期凋亡细胞;
  • 左下:(AnnexinV-染料)-/PI-,此区域的细胞为活细胞;
  • 右下:(AnnexinV-染料)+/PI-,此区域的细胞为早期凋亡细胞。

2)对照组凋亡比例高

  1. 与细胞的状态有直接的关系,细胞状态不好会使实验时凋亡比例高;
  2. 细胞收集后存放的时间太长,没有及时染色;
  3. 细胞表面原有的PS相对较多,应选用低浓度的Annexin V标记;
  4. 过分吹打、或胰酶消化等,可能使PS暴露出来,从而导致凋亡的比例高。

3)对照组凋亡比例低

  1. 凋亡刺激得不够;
  2. 细胞本身生长状态可能对刺激因素不敏感,如过度增殖的细胞对凋亡的诱导不太敏感;
  3. Annexin V的结合缓冲液失效,应4 ℃保存;
  4. 贴壁细胞消化时间过长,膜表面的PS受损,Annexin V结合位点减少。

4)坏死细胞比例高

中间检测的时间时候过长,PI受时间的影响很大,因为标记PI后会加大细胞毒性,特别是在检测早期凋亡时,如果时间延长会造成第一象限的细胞的比例加大。

4、操作注意事项

  1. 细胞的上清在操作过程中需要进行收集,因为凋亡的细胞可能会脱壁,悬浮于培养基,所以需要收集上清再离心取沉淀,合并消化下来的细胞,不然会对凋亡比例有影响;
  2. 对贴壁细胞而言,消化是最关键的步骤,消化液需用不含 EDTA 的胰酶,因为 AnnexinV 和 PS 的结合需要 Ca2+,而 EDTA 是 Ca2+螯合剂,使用含有 EDTA 的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长,吹打细胞要轻柔,因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤,造成假阳性;
  3. 神经细胞膜容易破坏外翻,导致假阳性,所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞;
  4. 必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

Tunel

1Tunel检测凋亡的实验原理

细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和荧光素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有 3'-OH 形成,很少能够被染色。由此,TUNEL 成为了检测 DNA 片段化(细胞凋亡)的最常用方法。

2Tunel检测的操作步骤(以组织切片为例)

1)将组织在二甲苯浸泡两次,每次10-20 min 来进行脱蜡;

2)通过以下步骤(按给定顺序)为组织复性:在 100%乙醇中两次洗涤5 min,然后依次在95%,70%和50%乙醇中洗涤3 min;

3)用 200-500 µL PBS 洗涤样品两次,每次 5 min;

4)排出组织中多余的 PBS,并在 20 µg/mL 蛋白酶 K(在 PBS 中,现配现用)溶液中孵育 15 min;

5)配制TdT 标记反应缓冲液;

6)向每个样品中加入 50 µL(96 孔板推荐 50 µL,24 孔板推荐 100-200 µL,切片建议添加 100-200 µL 盖住组织即可)反应混合物,并在湿盒中 37℃下避光孵育 2 h (不同的样本,可视情况调整孵育时间);

7)在 PBS 中将样品洗涤 3 次,每次 5 min;

8)通过在 PBS 中的 1×DAPI 中孵育 10 min 对样品进行复染;

9)将样品在 PBS 中洗涤 3 次,每次 5 min;

10)加入水性封固剂或防淬灭溶液,封住盖玻片,用荧光显微镜进行观察,再进行荧光显微镜拍照观察,红色通道(Ex/Em=555 nm/565 nm)。

3、Tunel实验常见的问题

1)假阳性

a.样本处理不当

  • 使用酸性或碱性固定液,导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞;
  • 固定液浓度过高,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS);
  • 固定时间过长,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min;
  • 蛋白酶K处理时间过长,破坏核酸结构,出现假阳性。建议适当缩短处理时间;
  • 蛋白酶K浓度过大,破坏核酸结构,出现假阳性。建议适当调整蛋白酶 K溶液浓度,一般工作液浓度为20 μg/mL。

b.染色操作不当

  • TUNEL染色时间过长。建议一般是 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色;
  • 未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次,来避免切片的非特异性染色。

2)荧光信号弱

a.样本处理不当

  • 样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点,便于染色;
  • 脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min,再使用二甲苯两次5-10 min;而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗;
  • Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间,常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min,30μm左右的片子孵育30 min;
  • Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL;
  • 放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜,减低染色效率。建议使用新鲜切片。

b.染色操作不当

  • 染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色;
  • TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度;
  • TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导致TdT酶失活;
  • 样本干燥。加上TUNEL反应液后,请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行,保证样本均匀染色,又可防止反应液干燥。

c.荧光操作不当

  • 操作未避光。由于荧光易碎灭,建议标记与检测样本时,载玻片要避光,观察时要尽量快。

3)荧光背景强

a.染色操作不当

  • TUNEL时间过长。建议染色时间适当,一般是 37 ºC 孵育60 min,避免串色;
  • TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数,优化浓度;
  • PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次,来避免切片样本中残留的染料。

b.荧光检测操作不当

  • 曝光时间过长。建议调整曝光条件,先对阴性组调整到无背景光,然后用这个曝光条件去拍摄实验组(可以微调,但是不需要大调)。

4、Tunel实验中的操作注意事项

  1. 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性组:用DNase酶处理,诱导细胞凋亡、暴露出3‘-OH末端。每次实验做一个即可;阴性组:不加TdT酶,其余操作和实验组相同;实验组:除了阳性组和阴性组,所有的样本均是实验组。
  2. 在选择固定液时,我们建议使用4%的多聚甲醛(PBS)进行固定,不建议选用乙醇和甲醇,也不能选用甲醛替代,因为市面上购买得到的甲醛大多含有甲醇。这会使我们后续的染色过程中标记效率降低,难以观察到荧光。
  3. 贴壁细胞在加药诱导凋亡后,细胞状态会发生改变,细胞形态皱缩边缘,其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时,需要小心操作,避免吹打造成的细胞脱落,尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。
  4. 荧光基团长期暴露在普通光照下,会发生严重淬灭,因此在实验操作上应尽量避光操作和孵育。

 

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