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ELISA实验及关键解读

发布时间:2021年11月10日 浏览次数:227

ELISA 即酶联免疫吸附测定,是一类常用的免疫酶技术。主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,然后利用酶标记(偶联)的抗体或抗原与之孵育,加入显色剂显色,通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异,绘制出酶活曲线得出待测物浓度。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。ELISA实验中有三种必要的试剂:

① 固相的抗原或抗体(用于结合到固相载体上);

② 标记的抗原或抗体(标记物);

③ 作用的底物(显色剂,用于显色)。

一、四种常见ELISA方法

1.直接ELISA法

将抗原固定于ELISA板上,然后用酶标抗体直检测抗原。

相较于其它类型的ELISA实验,直接ELISA实验步骤少,检测速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反应,测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的,样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA板结合,实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗,实验不太灵活。另外由于没有使用二抗,信号没有被放大,降低了测定的灵敏度。

2.间接ELISA法

先将抗原结合到ELISA板上,随后分两步进行检测:首先加入检测抗体与抗原特异性结合,随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

与直接ELISA相比,间接ELISA用到酶标二抗,具有更高的灵敏度,也需要更少的标记抗体,更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性,因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性(酶标二抗直接与抗原结合),可能会增加背景,同时与直接ELISA相比,间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤,实验周期延长。

3.夹心ELISA法

先将捕获抗体固定于ELISA板孔中,然后加入样品,接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体,则可称为直接夹心ELISA;如果检测抗体不带有标记,则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合,这种称为间接夹心ELISA。

夹心ELISA的灵敏度高,它比直接或间接ELISA敏感2-5倍;同时夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合,拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测,灵活性较高。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高,如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体,则需要进行配对抗体定制并进行优化,因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。

4.竞争ELISA法

预先将抗原包被在固相载体上,并加入酶标记的特异性抗体。实验时,加入待检抗原(或抗体),如果待检物是抗原,则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体;如果待检测物是抗体,则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体,最后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原(或抗体)的量成反比。

竞争ELISA相对以上介绍的三种方法更复杂一些,但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式。其主要优点在于可检测不纯的样品,且数据再现性高,但存在整体敏感性和专一性较差的问题。

二、ELISA常见问题与解决方法

1.阴性对照出现阳性结果

① 样品、试剂被污染,或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂,小心操作。

② 酶标板洗涤不彻底——洗板前先将抗体溶液倒干净,然后清洗液倒满板孔,确保能充分洗涤。

③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体,稀释抗体到适当浓度。

2.酶标板整体背景高

① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。

② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。

③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应,适当缩短显色时间。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的,若出现黄色或其他颜色表明受到污染,应更换新的底物溶液。

⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。

3.复孔之间重复性差

① 样品数量不整齐,加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第一次接近。

② 加样量不一致——样品稀释前应充分混匀,并且使用同一移液枪。

③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时,操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。

4.吸光值偏高或偏低

① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。

② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量。

③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间,确保待测样品与检测抗体能充分结合。

④ 孵育温度不适合——应保证抗体在最适宜条件下进行孵育(一般37℃孵育1h)。

三、洗涤参数

优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号,从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留,在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景,从而带来不理想的结果。

一些参数会影响洗涤步骤的效果。第一个主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景,那么不要犹豫,将洗涤量调为高,最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到,从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200 µl。如果你的试剂盒也是这样,那么制造商可能会建议使用300 µl洗涤液进行洗涤,以便清洁整个反应孔的壁。一般来说,洗涤量越高,则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。

1.洗涤次数的经验法则

第二个影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然,洗涤次数越多,背景越低。然而,太多次的洗涤会降低信号强度,使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过,ELISA板的制造商会对洗涤次数提出建议。一般而言,制造商包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板,必须优化洗涤次数。

控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说,96孔板的每个孔能容纳330至460 µl。不过,有些自动化洗板机可设置程序,分配远远超出这个量的洗涤液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其实很简单,就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说,随着分液器分配更多的液体,抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量,但不会溢出到其他孔中。

2.抽吸

另外,还有一些参数会影响洗涤步骤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置,这两者都能调整,以降低背景(残留量)和差异。

残留液体中包含未结合的抗原或抗体,它们会增加背景信号。残留量越小,残留液体越少,转移到下一步的干扰液体也就越少。

吸液高度会明显影响残留量,如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大,那就会让残留量急剧增加。反之,如果洗涤吸头压着反应孔底部,那么也会使吸液效率降低,残留量增加。

目前的洗板机一般使用两种类型的洗头:刚性和浮动的。浮动洗头中的吸头可在洗涤过程中自由上下移动,而刚性洗头则固定在适当的位置。使用刚性洗头的洗涤操作在优化起来更为复杂,因为需要非常仔细地调整吸液高度。如果实验室使用几种不同的板,那可能会很耗时。在使用浮动洗头时,吸头会降到反应孔的底部,调整高度就不是很重要,因此洗头会下降到底部。

抽吸的位置也对残留量有着重要影响,如果每个孔只使用一个抽吸点(这很常见,因为更快),那么抽吸的位置需要优化。最佳的位置取决于洗头的性状,但它几乎不在反应孔的中间,即使这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说,最佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。

反应孔的形状也会影响残留量,C形底(平底圆角)的微孔板一般会比那些平底尖角的微孔板残留量更低。

如果没有自动洗板机,采用手工洗涤,那么也需要注意几点:

  • 使用8道或12道微量移液器,采用倒吸的方法进行洗涤;
  • 不同厂家的洗液不宜相互混用,洗板时需保证微孔板平放,将洗涤液注满各孔,但尽量避免漏液溢液,以每孔300 µl为宜;
  • 板洗次数一般为3次,要保证洗板的浸泡时间,每次浸泡时间一般为30-60 秒;
  • 尽量减少洗液残留量,推荐每次洗板后进行拍板,并及时更换吸水纸,避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内。

ELISA看起来很简单,但是在实际操作过程中,也不能掉以轻心,还是应该仔细检查洗涤步骤,才能获得准确的结果。

四、产品推荐

产品名称 货号
EliKine™ Human PD-1 ELISA Kit KET6035
EliKine™ Human PD-L1 ELISA Kit KET6036
EliKine™ Human IgG ELISA Kit KET6034
EliKine™ Mouse IgG ELISA Kit KET7018
EliKine™ Mouse TNF-α ELISA Kit KET7015
EliKine™ Mouse IL-6 ELISA Kit KET7009
EliKine™ Testosterone ELISA Kit KET0001
EliKine™ Triiodothyronine (T3) ELISA Kit KET0006

 

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