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Abbkine胚胎免疫荧光(IF)实验标准操作规程

发布时间:2021年01月06日 浏览次数:394

一.细胞的固定

一般用PBS洗2遍,然后再做固定。当然,根据研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗,因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

另外在保存细胞爬片的时候,一般用培养皿或板,先在皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方便做实验时取片。然后盖上盖子,并在盖子上做标记,为避免混淆,可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

以下为常用的固定液
1.  冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心,丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)固定10分钟。取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。
2.  多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等,室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存。

3. 95%乙醇,可用于免疫组化。

优点:穿透性强、抗原性保存较好。

缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度,室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存。

4. 甲醛(福尔马林)应用最广。

优点:形态结构保存好,且穿透性强,

缺点:甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存。

 

二.细胞免疫荧光

  1. .收集实验处理后的细胞,每管细胞用预冷的PBS洗涤2次;
  2. 4%多聚甲醛1 mL室温固定10 - 30 min;
  3. PBS洗3次,每次5 min;
  4. 5% Triton X-100处理15 min后PBS洗三次,每次5 min;
  5. 10%驴血清室温封闭45 min;
  6. 加一抗4度摇床振荡孵育过夜或者37度孵育4小时,多标的话,将多种一抗按比例混合在一起,进行孵育;
  7. 加荧光抗体常温孵育摇床震荡1小时,注意避光,多标的话,将一抗对于的荧光二抗按比例混合在一起进行孵育;
  8. PBS洗三次,每次5 min;
  9. DAPI染色,室温,避光染色2 min;
  10. PBS洗三次,每次5 min;

用pbst洗涤的话,通透性会更好,配方:含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为:

称取磷酸二氢钾(KH2PO4),磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),氯化钠(NaCl),氯化钾(KCl),吐温-20 ,加水。

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