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蛋白纯化系列之His-Tag知多少

发布时间:2021年07月26日 浏览次数:479

金属螯合亲合层析,又称固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),最早由Paroth等人提出[1]。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理,从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合,其中以配价键结合为主,His-Tag是目前用于纯化蛋白的融合标签中应用最广泛的,一般为6-10个组氨酸组成。由于标签较短,可置于蛋白的C端或者N端[2]

histidine

以His-Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析,为重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,His-Tag纯化标签对目的蛋白的功能和下游应用影响甚微。免疫原性低,可以和多种标签连用,增加蛋白的纯度,且不形成二聚体。除此之外,His-Tag纯化的方法上样条件可选择范围广,在高盐、一定浓度的变性剂以及去垢剂的条件下,带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填料特异性结合,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

His-Tag蛋白纯化原理是组氨酸(His)的残基上带有1个咪唑基团,可以和Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上,因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合[3]。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为Ni-IDA和Ni-NTA。镍琼脂糖凝胶FF的配基是最经典的IDA,镍离子有六个螯合价位,Ni-IDA螯合了三价,剩余三价,而Ni-NTA螯合了四价的,剩余是两价。因此,Ni-IDA的载量更大,可以结合更多的蛋白[4]。NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落,纯化蛋白纯度更高,但以牺牲了蛋白载量来获得了蛋白的纯度。

Ni-NTA,Ni-IDA

另外,如果要纯化包涵体,可用8 M浓度的尿素处理菌体,在变性条件下进行纯化。如此优秀的His标签Ni-NTA蛋白纯化试剂盒,快来试试吧!

产品名称 货号 规格
PurKine™ 组氨酸标签 Ni【镍】-NTA树脂 BMR2001 5ml  /25ml
PurKine™ 组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(Ni【镍】-NTA) KTP2001 1ml /1ml*5
PurKine™ 内毒素清除树脂 BMR2140 5ml /25mL
PurKine™ 内毒素清除试剂盒(多粘菌素B) KTP2140 998/1ml*5

参考文献:

[1]Porath J, Carlsson J, Olsson I et al. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 258(5536): 598-9.

[2]Zouhar J ,  Nanak E ,  Brzobohaty B . Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific beta-glucosidase.[J]. Protein Expression & Purification, 1999, 17(1):153-162.

[3]徐莉莉, 陈革豫, 张腾,等. 新型镍离子亲和色谱介质的制备及其性能考察[J]. 色谱, 2016.

[4]李淑娟. (2007). 六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究. (Doctoral dissertation, 西北大学).

 

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