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Abbkine冰冻切片免疫荧光(IF)实验标准操作规程

发布时间:2021年01月06日 浏览次数:366
  1. 冰冻切片固定:冰冻切片室温晾干,置于冷丙酮固定10 min,于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。
  2. 抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中低火10-15 min,断电间隔10 min转至中低火10-15 min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。(修复液和修复条件根据组织来确定)
  3. 阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。
  4. BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织,室温封闭30 min。(一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭,一抗其它来源的用3%BSA封闭)
  5. 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
  6. 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织,室温孵育50 min。
  7. DAB显色:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。
  8. 复染细胞核:Harris苏木素复染3 min左右,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗。
  9. 脱水封片:将切片依次放入75%酒精6 min-85%酒精6 min--无水乙醇Ⅰ6 min -无水乙醇Ⅱ6 min-二甲苯Ⅰ5 min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
冰冻切片免疫组化实验结果判读

苏木素染细胞核为蓝色,DAB显出的阳性表达为棕黄色。

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