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Abbkine带你全面了解免疫荧光!

发布时间:2021年08月19日 浏览次数:554

1.什么是免疫荧光?

免疫荧光(Immunofluorescence, IF)技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体或抗原作为探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

2.免疫荧光的原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应,由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

3.免疫荧光的主要分类

(1)直接法

将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。

(2)间接法

如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗体—抗原—抗体复合物,再洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。

4.免疫荧光的步骤

(1)切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度(冰冻切片)等,防止裂片和脱片;

(2)组织切片固定:切好片风干后立即用固定液进行固定5-10 min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存;

(3)通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15 min.通透后用PBS洗涤3×5 min;

(4)血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min;

(5)一抗孵育:在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果更佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2 h,4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45 min)。具体条件需要自行摸索;

(6)二抗孵育:一般室温或37度30 min-1 h,具体时间需自行摸索,一定要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能会有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心;

(7)复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染;

(8)封片:为了长期保存,一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光淬灭封片液。避免产生气泡;

(9)切片清洗及荧光显微镜观察:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,一般在一抗孵育前的清洗是3 min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5 min *5次。

5.免疫荧光步骤常见技术问题及解决方法

1)背景染色较深

a:没有封闭非特异性结合或封闭不充分

使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭;改善封闭条件;

b:一抗及二抗的浓度过高

建议建立浓度梯度预实验,在单染的体系里找到最佳抗体浓度;

c:洗涤不充分

在洗涤缓冲液中加入0.2% Tween 20进行充分洗涤;

d:细胞培养过于密集

优化细胞生长条件,找到最佳接种密度。

2)信号弱或没有信号

a:靶细胞中没有目标蛋白

建议做阳性对照,制备细胞裂解液,用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达;

b:蛋白位于细胞质或者细胞核内

抗体不能穿透质/核膜,在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂;

c:没有足够的一抗与目标蛋白结合

延长孵育时间,增加抗体浓度;

d:固定步骤遮蔽了抗体识别表位(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)

缩短固定时间,更换固定剂。

3)荧光淬灭快

a:荧光素本身特性,光稳定性较差

选用光稳定性好的荧光素二抗;

b:封片剂

选用防荧光淬灭剂封片

4)有自发荧光

a:使用了戊二醛固定

在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4,NaBH4,甘氨酸等,染色前检查自发荧光;

b:可能就是自发荧光

设立阴性对照,通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色;

c:细胞成分中能够产生自发荧光的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量高

培养细胞中死细胞/活细胞比例高

总结

由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果,除了需要高质量的抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨的实验对照。总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

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