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新型柱式蛋白提取法

发布时间:2021年07月30日 浏览次数:504

RIPA裂解液作为样品总蛋白提取剂,已经有很多年的历史了,称它为最经典也是最常见的细胞组织快速裂解液也不为过。其原理是利用表面活性剂来裂解细胞膜,再从动物组织和细胞中抽取出可溶性蛋白。

RIPA法提取蛋白方便、快捷,大致步骤基本可以概括为称取样品,加入适量裂解液,研磨至充分裂解,离心取上清即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

可是经典常用的东西,并不一定意味着对。越来越多的科学家发现,RIPA法提取出的蛋白并不是十分准确,其缓冲液可能造成蛋白质的随机损失。大家在进项相关实验时,是不是会遇到些结果数据整理起来根本解释不通的情况,不断优化实验,小心翼翼操作,结果却也很难让人接受。这就有可能时在蛋白提取时出现了纰漏。

我们都知道,RIPA裂解液的配方中包含NaCl、Tris和EDTA,这些化学物质对蛋白质颗粒溶解的影响时未知的,又因为RIPA裂解液中SDS(主要用于裂解细胞膜)的含量较低,这些化学物质可能会细胞的不同结构及蛋白质的溶解起促进作用。

有研究称RIPA裂解液提取蛋白时,会人工激活caspase-3 and caspase-7;有研究称使用RIPA裂解液提取蛋白时,会人工增加激性 ;也有研究称RIPA裂解液提取蛋白时的不溶性组分中有明显蛋白丢失的情况,不溶性组分中包含很多蛋白,几乎所有的细胞外基质蛋白都在不溶性组分中;还有研究称RIPA裂解液提取蛋白时,不管是小分子蛋白还是大分子蛋白,都存在丢失情况,且这种丢失情况具有一定的选择性,不同样本的蛋白丢失情况也不同……这些都限制了RIPA法提取蛋白的后续实验。

 

 

RIPA法提取蛋白有很多的未知因素,也有很多人尝试优化RIPA的配方,通过改变各组分间的比例,以达到为提取特定小分子蛋白或其他蛋白的目的。结果都有所成效,但也需要大量时间与精力来验证,在我们的一般实验中并不实用。

现在,有了一款新型的柱式蛋白提取法,可以有效解决总蛋白提取过程中的蛋白丢失问题,几乎不产生不可溶性组分。通过裂解缓冲液中的表面活性剂对样本细胞进行裂解,金属螯合剂与蛋白结合得到粘性细胞裂解产物。将粘性细胞裂解物产转移至过滤装置内,通过离心,使粘性细胞裂解物通过滤装置。再通过过滤装置内的多孔过滤介质使粘性细胞裂解产物中的DNA、RNA、脂质和其他细胞组分截留在过滤管内,而蛋白质可以通过过滤管进入收集管,完成蛋白质提取的操作。

 

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