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干货|蛋白纯化知识小课堂开课啦,还不快来占领沙发?

发布时间:2021年05月18日 浏览次数:265

什么是蛋白纯化?蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。

每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来得到靶蛋白。

蛋白纯化的程序包括如下五个方面:

1.前处理:分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态,不丢失生物活性。对于不同的动物、植物、细菌不同的样本种类,前处理也会有相应的不同。

2.粗分离:当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。

3.细分离:样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。

4.离子层析法:当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH等办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

5.有机溶剂提取:蛋白质纯化有机溶剂提取的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下;引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如;在冰浴中磁力搅拌下;在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃);可以使冰核蛋白析出;从而纯化冰核蛋白。

常见的分离纯化方式:

1.根据蛋白质分子大小的差异分离——透析、超滤、凝胶过滤

①透析(dialysis)

原理:利用蛋白质分子不能通过半透膜而将其与小分子物质分开。

半透膜:玻璃纸或纤维素材料。

按照分子大小进行分离,分离取决于透析袋截留的分子量。透析只用来除盐类和小分子杂质。

 

②超滤(Ultrafiltration)

原理:是利用压力或离心力,强行使水和其他小分子溶质通过半透膜,而蛋白质留在半透膜上,以达到浓缩和脱盐的目的。

超滤法的应用,应明确截留什么和除去什么,选着合适的截留大小参数。1/2-1/3原则。

超滤原理图

 

超滤管的应用方法

 

③凝胶层析

凝胶层析亦称凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析等。其机理是分子筛效应,主要根据蛋白质分子的大小进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质。

  • 单个凝胶珠本身像“筛子”,不同类型凝胶的筛孔的大小不同;
  • 分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部,随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来,所以大分子物质迁移速度快;
  • 小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部,所以小分子物质迁移速度慢。

 

凝胶层析原理图

2.利用生物分子专一性结合的特性——亲和层析(Affinity chromatography)

亲和层析是一种吸附层析,依赖于蛋白质和它的配体(ligand)之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合(一般是非共价结合)的分子、基团、离子或原子。但在亲和层析中,配体是通过共价键先与基质结合,配体可以是酶结合的一个反应物或产物,或是一种可以识别靶蛋白的抗体。具有很高的特异性,所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。

蛋白质是复杂的生物大分子,在生物体中扮演着重要的角色。它们在细胞内执行众多任务,涉及生物体的组织和器官的结构发育和位置、功能及其调控。对于分析蛋白质个体和蛋白质复合物,鉴定蛋白质与蛋白质、核酸之间的相互作用,蛋白质的纯化是这些研究的基石。

由于纯化天然蛋白是一件极具挑战性的工作,科学家开发出来利用标签融合蛋白来捕获纯化和检测目的蛋白的实验体系,包括His标签、GST标签、HA标签、DDDDK(Flag)标签、Myc标签、MBP标签以及生物素标签等。

另外,我们还推出了许多抗体纯化的工具,主要涉及从血清(多克隆抗体)、腹水和杂交瘤细胞系培养上清液(单克隆抗体)中选择性富集或特异性分离抗体。Protein A,Protein G和Protein L是三种细菌蛋白,因其与抗体的高效结合而被大家所熟知。

这些蛋白经过基因工程编辑重组表达,通常用于从各种不同物种中进行关键抗体类型的亲和纯化。

对于亲和层析,Abbkine有一系列蛋白抗体纯化的工具,包括填料,预装柱和试剂盒,面对不同客户的需求。详情请咨询热线027-59716789,邮箱:support@abbkine.com.

 

产品种类 货号
His 标签蛋白纯化工具 BMR20000
GST 标签蛋白纯化工具 BMR20100
MBP 标签蛋白纯化工具 BMR20206
Flag 标签蛋白纯化工具 BMR21504
Biotin 标签蛋白纯化工具 BMR20306
Protein A抗体纯化工具 BMR21604
Protein G抗体纯化工具 BMR20600
Protein A/G抗体纯化工具 BMR20704
Protein L抗体纯化工具 BMR20800

为了广大“因粉”的厚爱,我们还会有很大科研惊喜等着大家哟。我们还有大量的细胞因子新指标将会陆续与大家间。同时,Abbkine的技术专家为了给广大读者提供学习生物知识的平台,经过不懈努力,将多种高端生物实验的干货整理出来,后期陆续在微信公众号中刊登,请广大热爱科学的读者持续关注官方公众号:Abbkine.

 

Abbkine专注于蛋白学和细胞学领域,致力于创新和研发各类抗体、蛋白质、分析试剂与试剂盒,以期成为生命科学研究发展、药物研发等领域的关键推动者。我们为您提供蛋白和免疫研究用户最喜爱的产品,从免疫学基础产品,如蛋白提取定量,到免疫学实验的内参标签抗体、一抗及二抗等;细胞研究用户最喜爱的产品,从用于检测细胞状态的染料及试剂盒,细胞器提取试剂盒,细胞亚结构染色示踪及细胞代谢检测产品,到用于细胞培养的细胞因子及蛋白类检测试剂盒,只为助力您的研究事业!

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