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蛋白纯化专题|蛋白纯化折腾了半个月没结果, 还不来看硬核分享?

发布时间:2022年07月28日 浏览次数:300

目前,对于基因工程技术生产的重组蛋白的纯化方法有很多,按照大类可分为沉淀技术、层析技术、双液相萃取技术等。不管是哪一种方法,其分离纯化的原理都是利用其物理和化学性质的差异,物理性质包括分子的大小、形状、溶解度,化学性质包括等电点、疏水性以及与其他分子的亲和性等性质。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化两个阶段。粗分离主要将目的蛋白和其他细胞成分如 RNA、DNA 等分开,如硫酸铵沉淀法。精细纯化是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来,常用的精细层析技术按照原理分为两类:非吸附层析和吸附层析。然而,在蛋白纯化过程中常常会遇到以下难点:

  • 柱子容易堵塞,纯化速度慢;
  • 蛋白不稳定,易发生浑浊变性等现象;
  • 正常表达的蛋白,纯化的效率很低;
  • 纯化的蛋白出现较多杂带;

 

眼瞅着暑期快要过完,原本计划做好实验放飞自我,数据却一直出不来,别人做蛋白纯化几天搞定,我做蛋白纯化只能靠手动,半个月反反复复结果依旧让人...

只好请教老板,如何快速搞定蛋白纯化实验?

 

小白:老师,这个仪器镍柱好像堵了,每次开机要启动好久,基线还漂移的很过分,平衡的时间越来越久,一上午都耗在等机子上了。

老师:这个机器的镍柱是刚换的,如果你样品杂质颗粒处理的比较好,液料比也合适的话,就要看纯化上清时蛋白质有没有产生絮状沉淀,尽快加入 DTT 还原。至于基线花长时间都不平的问题啊,同学们给我反映很多次了,但仪器用的太久了,我也很无奈。

 

小白:老师,那实验过程中会出现浑浊现象,这个是什么原因呢?

老师:有可能是你实验的蛋白自身不稳定,需要检查缓冲体系是否适宜,环境是否温度太高,你可以加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,浑浊现象会消除。

 

小白:老师,蛋白经常不挂柱,怎么办呢?

老师:这个可能的原因比较多,主要包括如下5个:

1.超声功率不恰当:过大使得蛋白碳化,过小蛋白没有释放。建议调整超声功率或超声前添加溶菌酶增加细胞破碎率。

2.缓冲液条件不合适:缓冲液中 EDTA、柠檬酸等金属离子螯合剂浓度不能过高,也可以适当提高 pH。

3.His 标签未充分暴露:在蛋白中加入适量的尿素或盐酸胍等变性剂纯化或上游分子水平改变 His 的长度或位置使其暴露在蛋白表面。

4.His 标签未充分暴露:在蛋白中加入适量的尿素或盐酸胍等变性剂纯化或上游分子水平改变 His 的长度或位置使其暴露在蛋白表面。

5.柱子过载:更换大体积柱子或多柱串联。

 

小白:蛋白挂柱后洗脱不下来?

老师:洗脱不下来的原因主要有3种:

1.洗脱条件太温和:增加缓冲液中咪唑浓度或者适当降低缓冲液 pH。

2.非特异性的疏水或者其他相互作用:加入非离子去污剂或者增加 NaCl 的浓度。

3.蛋白沉淀:适当降低上样量或蛋白浓度,用咪唑线性洗脱;使用添加剂或者改变 NaCl 的浓度,或者在变性的条件下洗脱。

 

小白:蛋白洗脱后的杂质很多,怎么处理呢?

老师:洗脱后的蛋白杂带多的原因主要有如下3种:

1.蛋白酶降解部分目的蛋白:添加蛋白酶抑制剂改进。

2.杂蛋白与洗脱柱亲和力高:优化咪唑浓度或改善 pH、NaCl 浓度。

3.杂质蛋白与目的蛋白相互作用:超声前加入去垢剂或还原剂减少非特异性作用。

 

 

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