1.首先我们来了解一下CCK8

细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8 法）是基于高度水溶性的四唑盐 WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）来进行测定的。WST-8 在电子介体的作用下可还原生成水溶性甲瓒产物，产生颜色反应。CCK-8 是非放射性的，可在细胞增殖和细胞毒性实验中，对活细胞进行灵敏的比色测定，从而计算出细胞数量。WST-8 被细胞中的脱氢酶还原而生成橙色产物（甲瓒），可溶于组织培养基中。细胞中脱氢酶产生的甲瓒产物的量与活细胞的数量成正比。

2.CCK8的优势？

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。

1. 首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲臜产物（formazan）不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。
2. 其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。WST-8比XTT和MTS更稳定，从而使实验结果更加稳定。
3. WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
4. 其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，无需预制，即开即用。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

CCK8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较：

3.CCK8的操作步骤

a. 细胞计数方案

1)在 96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将板在潮湿的培养箱中预先培养（例如 37℃，5% CO2）；

2)在平板的每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰 OD 值读取；

3)在培养箱中将平板孵育 1-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定；

4)使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

b. 细胞增殖/毒性检测方案

1)在 96 孔板中接种 100 μL 细胞悬液（5×10³ 个细胞/孔）。将板在潮湿的培养箱中预培养 24h（例如 37℃，5% CO2）；

2)在平板中加入 1-10 μL 各种浓度的待测物质； 3. 在培养箱中将平板孵育适当的时间（例如 6、12、24 或 48 h）； 4. 向板的每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰 OD 值读取； 5. 在培养箱中将平板孵育 1-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定； 6. 使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

4.注意事项

1)由于 CCK-8 分析基于活细胞中脱氢酶活性的检测，因此影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致实际活细胞数与使 用 CCK-8 分析确定的细胞数之间存在差异；

2)混合或重悬组分时，避免产生气泡，因为它们会影响 OD 值读取； 3)孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（最多 4 h）或大量细胞（~10⁵ 个细胞/孔）；

4)如果由于长期培养而改变了培养基的颜色或 pH，请在添加 CCK-8 时更换培养基；

8)由于 CCK-8 的毒性低，因此相同的细胞可用于其他细胞分析。

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