原理

凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它能从组织中清除不需要的、受损的或衰老的细胞。在正常细胞中，负性磷脂位于细胞膜的内侧，而膜的外表面则被不带电的磷脂（PS）所占据。当细胞进入凋亡状态后，带负电的PS从质膜的内叶向外叶运输，使PS暴露在细胞外环境中。人抗凝血剂Annexin V是一种35-36 kDa Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。Annexin V标记有荧光团或生物素，可通过与外叶PS结合识别凋亡细胞。碘化丙啶（PI）是一种荧光核染料，对活细胞和凋亡细胞不敏感，但对死细胞有红色荧光染色，与细胞内的核酸结合紧密。Annexin V-AbFlourTM 647细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）为细胞凋亡提供了一种快速简便的检测方法。在提供的结合缓冲液中用Annexin V-AbFlourTM 647和PI染色细胞群后，早期凋亡细胞显示细胞膜暗红色荧光，死细胞显示细胞核红色荧光和细胞膜暗红色荧光。活细胞几乎没有荧光。检测可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行分析。

自备耗材

·离心机

·移液器及吸头 

·去离子水

·载玻片

·荧光显微镜或流式细胞仪

·96孔板（细胞培养用）

试剂准备

1×Annexin V Binding Buffer：用去离子水把Annexin V Binding Buffer (5×)稀释成1×Annexin V Binding Buffer。

Annexin V-AbFlourTM 647：即用型；使用前，平衡到室温。

Propidium Iodide (PI)：即用型；使用前，平衡到室温。

实验步骤

A.流式细胞仪分析

1．通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。

2．4℃，300 g离心5 min收集1-2×105细胞，用冰预冷的PBS洗涤两次。

注意：贴壁细胞使用胰酶消化后离心收集细胞，消化时间如果过长，易造成细胞膜结构损伤而出现细胞坏死的假阳性，所以需控制胰酶消化时间。

3．用100 µL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

4．每100 µL细胞悬液中加入4-5 µL Annexin V-AbFlourTM 647和1-2 µL PI，轻柔混匀。

5．室温避光孵育15 min。

6．孵育结束后加入400 µL 1×Annexin V Binding Buffer，轻柔混匀后置于冰上。染色后30 min内通过流式细胞仪分析细胞。使用650 nm和535 nm激发，665 nm和617 nm附近测量荧光。

B.荧光显微镜分析

1．对于悬浮细胞：

(1)按照步骤A.1到步骤A.6的流式细胞分析步骤。

(2)将步骤A.6的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤镜通过荧光显微镜分析细胞。

2．对于贴壁细胞，按照以下操作步骤：

(1)细胞接种于爬片或腔室载玻片上，培养细胞。

(2)通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。

(3)除去培养基，用PBS洗涤细胞两次。

(4)准备工作液：每100 µL 1×Annexin V Binding Buffer添加4-5 µL Annexin V- AbFlourTM 647和1-2 µL PI，轻柔混匀。

注意：最佳浓度可根据具体实验要求确定。

(5)在细胞中加入适量的工作液（确保工作液完全覆盖细胞），室温避光孵育15-30 min。(可以在冰上孵育，以减缓凋亡过程，但孵育时间需延长到至少30 min)。

(6)用1×Annexin V Binding Buffer洗涤细胞两次。

注意：此步不要使用PBS洗涤细胞。

(7)载玻片上添加一滴1×Annexin V Binding Buffer，然后将细胞爬片置于在载玻片上。对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够的1×Annexin V Binding Buffer覆盖细胞。

注意：也可使用抗荧光淬灭封片剂封片。

(8)使用适当的滤光片在荧光显微镜下分析细胞。

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