原理

线粒体是真核细胞产生能量的场所，具有双层膜结构，包括线粒体外膜以及折叠的内膜。在完整线粒体内膜上有一个电压梯度（膜电位=△Ψm），外正内负。线粒体跨膜电位破坏是细胞凋亡发生后最早发生的细胞内变化之一。基于碳青胺染料JC-1，线粒体膜电位分析试剂盒（JC-1法）可用于检测线粒体跨膜电位的变化，为鉴别正常细胞和凋亡细胞提供了一种简便的方法。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以产生红色荧光（Ex/Em = 585/590 nm）；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体（monomer），可以产生绿色荧光（Ex/Em = 510/527 nm）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。JC-1可以作为多种细胞的线粒体膜电位指标，包括肌细胞和神经元，以及完整的组织或分离的线粒体。试剂盒包含CCCP，它能使质子梯度解偶联，可作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。  

自备耗材

·培养板、可调节式移液枪及枪头

·离心机、37℃，5% CO₂细胞培养箱

·荧光显微镜或流式细胞仪

·去离子水

试剂准备

JC-1 Stain (100×): 使用前，平衡到室温；-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

CCCP (50 mM): 使用前，平衡到室温；-20℃分装保存，避免反复冻融。

PBS (10×): 加入去离子水稀释成1×PBS；4℃保存。

实验步骤

A. 用流式细胞仪进行检测

1. 对于非贴壁细胞，300 g离心5 min收集细胞，用1×PBS清洗2次。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶消化细胞，然后300 g离心5 min离心收集细胞，用1×PBS清洗2次。弃去1×PBS，加1 mL细胞培养基重悬细胞，细胞密度为1×10⁶个/mL。

2. 阳性对照的设置：阳性对照孔培养基中加入1 μL CCCP (50 mM)，其终浓度为50 μM，充分混匀，在37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育5 min。

注意:（1）对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。（2）建议保留未染色对照细胞（即不带JC-1染色），细胞悬浮在检测缓冲液中，使处理过的和未处理的样品都能通过流式细胞仪。

3. 每孔培养基中加入10 μL JC-1 (100×)，充分混匀，37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育15-30 min。

注意：1）不同细胞染色时间不同。正式实验前，做预实验确定最佳孵育时间。2）选择细胞状态好进行染色，以获得最佳实验结果。

4. 37℃孵育结束后，400 g，4℃离心3-4 min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

5. 加入1 mL预冷的1×PBS重悬细胞，400 g，4℃离心3-4 min，沉淀细胞，弃上清，重复洗涤1次。

6. 将细胞重悬于500 μL预冷的1×PBS中，流式细胞仪立即分析细胞。在FITC通道（通常为FL1），可检测到凋亡细胞中的JC-1单体，呈扩散绿色荧光。正常细胞中，JC-1聚集体可在PI通道（通常为FL2）中检测，呈点状红色荧光。

注意：染色后尽量在30-60 min内完成上机检测。

B. 用荧光显微镜检测

1. 悬浮细胞，遵循流式细胞仪的方案A1-6步骤，将步骤A6收集的细胞悬液放置于载玻片上，用盖玻片盖住细胞。选择合适的滤光片对细胞进行荧光显微镜分析。

2. 对于贴壁细胞：建议的方案如下所示：

（1）以6孔板为例，每孔加入1 mL细胞培养基。其他培养器皿以此类推。

（2）阳性对照的设置：阳性对照孔培养基中加入1 μL CCCP (50 mM)，其终浓度为50 μM，充分混匀，在37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育5 min。

注意：对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

（3）每孔培养基中加入10 μL JC-1 (100×)，充分混匀，37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育15-30 min。

注意：1）不同细胞染色时间不同。正式实验前，做预实验确定最佳孵育时间。2）选择细胞状态好进行染色，以获得最佳实验结果。

（4）37℃孵育结束后，吸除上清，用1×PBS洗涤2次。

（5）加入500 μL室温的1×PBS，在荧光显微镜下观察细胞。

注意：酚红不干扰JC-1染色。染色后尽量在30 min内完成拍照。

注意事项

1. JC-1 (100×)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2. JC-1探针装载完并洗涤后尽量在30 min内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

3. CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

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