原理

细胞的侵袭性，是指细胞受到外来信号的刺激，由一个地方侵袭到了另一个地方的特性，通常发生在比如伤口愈合，细胞分化，胚胎发育和肿瘤转移的过程中。Transwell是一种能在体外模拟机体许多黏膜及生物屏障系统的实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室，Abbkine的细胞侵袭分析试剂盒（24孔板，8 µm）采用聚碳酸酯膜（8 µm孔径）来测定细胞的侵袭特性，Matrigel（基质胶）是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。原理是将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质。如果上室的细胞要转移到下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，通过染色和洗脱，计数细胞量来反映细胞的侵袭能力。

自备耗材

·侵袭性细胞系

·10%胎牛血清的细胞培养基

·无血清培养基（即0%胎牛血清的细胞培养基）

·细胞培养箱（37℃，5% CO₂）

·PBS、棉签、镊子、96孔板、24孔板、可调节式移液枪及枪头

·显微镜

·酶标仪（能测570 nm处的吸光度）

试剂准备

24-Well Invasion Plate：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Matrigel：4℃解冻；使用前置于冰上，用不完的试剂-80℃分装保存。

Fixation Solution：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Staining Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Elution Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

实验步骤

注意：正式实验之前，一定要进行预实验，确定细胞侵袭的最佳实验条件。细胞必须有分泌基质金属蛋白酶（MMPs）的能力，才能进行细胞侵袭。建议实验前进行qPCR预实验检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

1. 准备基质胶：将枪头、枪头盒、EP管、无血清培养基与24-Well Invasion Plate放入冰箱预冷。Matrigel从-80℃拿出，4℃解冻Matrigel，融化后置于冰盒操作实验。

注意：Matrigel形成凝胶之前，全程用预冷的无菌枪头混匀，Matrigel融化后为澄清的液体。

2. 稀释基质胶：在超净工作台中用预冷的无血清培养基稀释Matrigel。

注意：（1）根据实验条件选择Matrigel合适的稀释比例，稀释比例设置范围为Matrigel：无血清培养基=1:6-1:8，建议稀释比例为1:6。（2）稀释后未用完的Matrigel不建议保留再用。

3. 预冷的无菌枪头吸取45 µL稀释后的Matrigel，加入24-Well Invasion Plate上室中，均匀平铺在底部，放入细胞培养箱（37℃，5% CO₂）中孵育1 h，使Matrigel聚合成凝胶，依据凝胶成膜的实际效果，孵育时间可适当延长。

注意：铺胶过程不要产生气泡，均匀铺胶。一般孵育1 h即可凝胶，凝胶后很难看清，可直接做下一步实验。

4. 将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100 µL无血清培养基后，于培养箱放置30 min，进行基底膜水化。

5. 将上室中液体吸掉，检查液体没有穿过小室进入到下室后，接种细胞。

注意：若有液体进入下室，可能实验结果会不准确，建议重新铺胶。

6. 用无血清培养基将细胞稀释至0.5-5.0×10⁶个细胞/mL，制备细胞悬液。

注意：做细胞侵袭前，建议细胞饥饿过夜。

7. 在下室中加入600 µL含有10%胎牛血清或所需化学引诱剂的培养基，然后加小室润湿，在上室中加入100 µL的细胞悬液。

注意：（1）上室和下室的溶液一定不要产生气泡，这样侵袭作用会减弱；（2）细胞状态很关键，尽量选用传代次数较少的细胞。

8. 在细胞培养箱（37℃，5% CO₂）中培养12-48 h。

注意：过长的培养时间可能会导致部分侵袭的细胞从膜底面脱落，建议通过预实验选择合适的培养时间。

9. 小心地取出小室，吸出上室中的培养基，用湿棉签的末端轻轻擦去上室未侵袭的细胞。

注意：擦去上室未侵袭的细胞，动作一定要轻柔，不要刺破聚碳酸酯膜。

10. 将小室转移到含有600 µL Fixation Solution孔中，室温固定10 min，PBS清洗3次。

11. 再将小室转移到含有600 µL Staining Solution孔中，室温染色5-15 min，PBS清洗3次，每次3 min，晾干。（若小室仍有较深着色，建议在装有PBS的烧杯中轻轻清洗小室3次，晾干）。

注意：环境温度和试剂温度均会对染色所需时间产生影响，但较短的染色时间只对着色的深浅造成影响，如果颜色较浅可适当加温或延长染色时间来达到所需的染色效果，在37℃浸染15 min可保证充分着色。

12. 小室放在干净孔中，显微镜选择至少3个视野观察并拍照，计算侵袭细胞数量。

13. 拍完照后，在下室中加入400 µL Elution Solution，洗脱10 min，将Staining Solution完全洗脱下来，吸取洗脱后的溶液200 µL到96孔板中，在570 nm处测量OD值。

注意：（1）通常在22-28℃的室温环境下，需要10 min完成洗脱，可依据温度的差异适当调整洗脱时间。（2）可依据具体实验需求选择染色拍照和测量OD值。

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