N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）活性检测试剂盒实验解决方案
发布时间：2025-02-14
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原理
N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52，N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG）广泛分布于各种组织中，是一种细胞内溶体酶，测定NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。CheKine™ N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和培养细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成对硝基苯酚，后者在400 nm有最大吸收峰，通过测定400 nm下吸光度的变化来计算NAG活性。
自备耗材
·酶标仪或可见光分光光度计（能测400 nm处的吸光度）
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
·水浴锅、低温离心机
·去离子水
·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Reagent I：临用前配制；48 T加入1.5 mL去离子水，96 T加入3 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光保存1个月。
Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Standard：即用型；5 μmol/mL对硝基苯酚溶液，临用前用蒸馏水将标准品稀释8倍得0.625 μmol/mL的标准溶液。4℃避光保存。
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用。Standard有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
样本制备
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。
1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，15,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
2.细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s），然后15,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
3.血清（浆）等液体样本：直接检测。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到400 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中依次进行）：
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
ReagentⅠ | 0 | 0 | 25 | 0 |
Reagent II | 35 | 35 | 35 | 35 |
Standard | 0 | 10 | 0 | 0 |
去离子水 | 35 | 25 | 0 | 25 |
样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
迅速混匀，37℃反应30 min | ||||
Reagent III | 130 | 130 | 130 | 130 |
3.充分混匀，记录400 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。
注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.02可适当加大样本量。如果ΔA测定大于1.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
NAG活性的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：每毫克蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG(U/mg prot)=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×1,000×V样÷(Cpr×V样)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
酶活单位定义：每克样本在反应体系中每分钟生成1 nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG(U/g 鲜重)=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×1,000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W
（3）按照细菌或细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG(U/104)=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×1,000×V样÷(n×V样÷V样总)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷n
（4）按样本体积计算：
酶活单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟催化生成1 nmol对硝基苯酚为一个酶活力单位。
NAG(U/mL)=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×1,000×V样÷V样总÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准
C标准：标准溶液的浓度，0.625 μmol/mL；V样总：提取液体积，1 mL；V样：加入的样本体积，0.01 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30 min；n：细菌或细胞数量，以万计；W：样本质量，g；1,000：换算系数，1 μmol=1,000 nmol。
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