在化学发光免疫印迹实验中，您是否经常面临这样的困境：目标蛋白条带信号微弱，难以区分特异性与非特异性结合；或者信号过强，导致核心区域瞬间过曝反白？这些问题的本质，在于化学发光底物的灵敏度与靶蛋白丰度之间的错配。

接下里跟着因因一起看看ECL发光原理，并基于SuperKine™系列两款产品的实际性能，看看不同目的蛋白应该选哪种灵敏度的发光液吧。

一、反应原理

发光液的化学发光体系是基于鲁米诺及其衍生物的氧化发光反应。

底物工作液由A液与B液按1:1新鲜混合而成。A液主要含鲁米诺及免疫信号增强组分，B液则含过氧化物及稳定剂。当工作液覆盖至转印膜上，标记在二抗上的辣根过氧化物酶将催化过氧化物分解，产生活性氧自由基。自由基随即氧化鲁米诺分子，使其跃迁至激发态。处于激发态的鲁米诺在返回基态时，会释放波长为425 nm的光子，从而被X光胶片或化学发光成像仪所捕捉。

信号强度与膜上HRP的局部浓度呈正相关，而HRP浓度又直接对应靶蛋白的丰度。因此，化学发光的核心便是精确、稳定地将蛋白丰度差异转化为光信号差异。

二、SuperKine™ ECL发光液对比

结果展示：

BMU102发光液曝光条带图

BMU101发光液曝光条带图

三、你的蛋白应该选择哪种发光液呢？

常见FAQ

Q：使用BMU102-CN飞克级发光液时，条带中心出现空心反白，是什么原因？

A：此为高丰度蛋白或在抗体浓度过高时出现的典型现象。由于HRP局部浓度极高，发光反应过于剧烈，短时间内将工作液中的底物分子大量消耗，导致发光核心区迅速淬灭。

建议：(1) 降低蛋白上样量或提高一抗/二抗稀释倍数；

减少发光液孵膜时间，缩短曝光时间；

可更换成皮克级的BMU101增强型发光液，其线性范围与高丰度样本更为匹配。

Q2：ECL发光工作液可否回收，进行多次孵育与曝光？

A：不建议回收使用。工作液一旦与膜上HRP接触，化学反应即已启动，底物处于不断消耗中。

建议：将ECL工作液滴加到膜上，使其均匀覆盖到膜上后上机曝光。

Q3：曝光条带较弱，是什么原因？有没有好的解决办法？

A：蛋白表达丰度低或上样量低、抗体稀释比例过高等因素会导致曝光时间长、曝光条带弱。

建议：可使用TBST将曝光过的膜重新洗涤2-3遍，每次1min，然后换上更加灵敏的ECL（如BMU102-CN）再次曝光，不需要重新上样转膜。

Q4：操作中有哪些关键点能保证发光液的最佳效果？

A：(1) 更换枪头：A液与B液吸取时务必更换枪头，互相污染均会引发整瓶试剂背景升高并逐渐失效。

现配现用：发光工作液配制后应尽快使用。

正确的保存与复温：试剂于4℃储存，如出现结晶，可置于室温或温水浴中溶解并混匀，不影响性能，购买的大包装建议分装，减少与空气接触的时间。使用前，上下摇晃混匀，获得最佳效果。

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