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Abbkine带你全面了解WB!

发布时间:2021年08月12日 浏览次数:480

一、什么是WB?

Western blot(WB),中文名称“蛋白免疫印迹”,是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白从凝胶转移到固相载体上,而后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。

二、为什么要做WB?

1. 首先是蛋白的表达差异,研究者想了解目的蛋白是否在相应的组织或者细胞中表达;

2. 第二个是有关信号通路的研究,研究者想研究在病理或者生理状态下或者药物处理后,目的蛋白在目标组织或者细胞中的表达量以及位置上的变化;

3. 第三个是研究者想了解目的蛋白与其它蛋白的相互作用;

4. 最后一个是研究者想了解重组蛋白表达与否以及表达的完整性。

三、WB的原理及实验操作步骤?

1. 原理:WB是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开,然后转移到固相载体(杂交膜),最后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白,对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测,既可以定性又可以半定量的WB是初步鉴定蛋白质最通用也是最方便的方法。

2. WB实验操作步骤

  • A. 电泳分离蛋白质,由裂解细胞或组织制备目的蛋白质样品,经SDS-PAGE电泳处理后,不同分子质量大小的蛋白质得到分离;
  • B. 转膜,将电泳分离的条带从凝胶转移至NC/PVDF膜上。常用的方法是电洗脱或电泳转移,形成“负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵-正极”转膜结构,在施加电场后蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并吸附在膜表面;
  • C. 抗体孵育,用目标蛋白的抗体(一抗)处理膜,漂洗除去未结合的抗体,膜上仅含有目标蛋白结合的一抗。再用标记的二抗进行酶免疫定位;
  • D. 显影分析,根据信号的强弱调整曝光时间或不同时间多次压片以达到最佳效果,曝光完成后迅速浸入显影液中显影,待条带明显后停止显影,分析结果。

四、WB常见解决问题及方法

1. 无目标条带

  • A. 检验样本里是否含有目标蛋白;目标蛋白的表达丰度是否在检测范围之内;
  • B. 确认一抗和二抗是否匹配,以及一抗和二抗的浓度是否匹配;
  • C. 检查抗体是否能够识别样本种属中的目标蛋白;
  • D. 检验目标蛋白是否有效的转移到膜上,并确认转膜效率;
  • E. 确认洗涤次数是否过多,一般3-5次,每次5分钟。

2.背景偏高

  • A. 未进行非特异性封闭或者封闭不充分;
  • B. 一抗浓度过高;
  • C. 孵育温度过高;
  • D. 二抗与封闭剂非特异性结合或反应;
  • E. 未结合蛋白质洗涤不充分;
  • F. 膜的选择导致的高背景。

3.出现多条带

  • A. 细胞传代次数过多,累计了很多差异,建议以没有传代的细胞系设置平行对照;
  • B. 目标蛋白有很多种修饰,例如acetylation, methylation, myristylation, phosphorylation, glycosylation etc.查阅文献并使用去修饰的试剂验证;
  • C. 确认目标蛋白是否被降解了;
  • D. 二抗与封闭剂非特异性结合或反应;
  • E. 确认目标蛋白是否有剪切活化的形式;
  • F. 一抗浓度和二抗浓度可能太高;
  • G. 确认目标蛋白是否有二聚体或者多聚体形式,建议电泳前延长煮沸时间到10mins,同时 loading buffer 里应含有还原剂。

4.条带和预期大小不一致

  • A. 翻译后修饰-例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白质大小;
  • B. 翻译后切割-例如,许多蛋白先被合成为前蛋白,然后被切割产生活性形式,例如前半胱天冬酶;
  • C. 剪接变体和异形体-可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质;
  • D. 相对电荷-氨基酸(带电和不带电)多聚体组分,例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止,但强相互作用会导致较大的条带出现。

5.如何选择合适的内参

  • A. 种属来源:样本的种属来源不同,内参的选择也是不一样的。哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内参;同样的,植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参;
  • B. 细胞定位:靶标蛋白的细胞定位不同,适合的内参也不同。如全细胞裂解液可选择β-actin、β-tubulin 等,膜蛋白一般选择 Na+/K+ ATPase,核蛋白则选择 Lamin B1、Histone H3等;
  • C. 分子量:一般目的蛋白与内参蛋白大小至少相差 5KD以上;
  • D. 表达因素:内参的选择还需要考虑实际的实验环境。GAPDH 是代谢类蛋白,在活组织中表达较稳定。β-Actin 和 β-Tubulin 是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性。在组织缺氧、糖尿病等因素条件下会导致 GAPDH 的表达增高,此种情况下 GAPDH 就不适合做内参。

6.用牛奶和BSA封闭有区别吗?

  • A. 一般来讲,BSA 会产生更清晰的结果,因为 BSA 含有较少的蛋白,因而抗体较少与其发生交叉反应;
  • B. 牛奶含有更多种类的封闭蛋白,能封闭更多不同类型的蛋白质。不推荐用于磷酸化蛋白的研究;牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白,可能会导致抗体的非特异性结合,形成高背景。

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产品名称

货号 定位 反应性 应用类型

规格

Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody (1C7) A01010 全细胞内参(43KD) 人,小鼠,大鼠,兔等 WB, IHC-P, IF 50/200/200μLx5
Anti-beta Actin Rabbit Polyclonal Antibody A01011 人,小鼠,大鼠,兔等 WB, IHC-P 50/200/200μLx5
HRP Conjugated Anti-beta Actin Mouse Monoclonal Antibody (1C7) A01015 人,小鼠,大鼠,兔等 WB 50/200/200μLx5
Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody (2B5) A01020 全细胞内参(37KD) 人,小鼠,大鼠,兔等 WB, IHC-P, IF 50/200/200μLx5
Anti-GAPDH Rabbit Polyclonal Antibody A01021 人,小鼠,大鼠,兔等 WB, IHC-P 50/200/200μLx5
Anti-β-Tubulin Mouse Monoclonal Antibody (3G6) A01030 全细胞内参(55KD) 人,小鼠,大鼠,兔等 WB, IHC-P, IF 50/200/200μLx5
Anti-α-Tubulin Monoclonal Antibody (3G5) A01080 全细胞内参(52KD) 人,小鼠,大鼠 WB, IHC-P, IF, IP 50/200/200μLx5
Anti-PCNA Mouse Monoclonal Antibody (1D7) A01040 细胞核内参(29KD) 人,小鼠,大鼠 WB, IHC-P, IF 50/200/200μLx5
Anti-Histone H3 Mouse Monoclonal Antibody (2D10) A01070 细胞核内参(15KD) 人,小鼠,大鼠,酵母 WB, IHC-P, IF, IP 50/200/200μLx5
Anti-Histone H3 Monoclonal Antibody (2D9) A01100 斑马鱼 WB 50/200/200μLx5

 

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