高效率WB，拒绝emo，开心科研带你飞

五一小长假虽然过去了，但是节前的WB实验“小烂摊”还是得回头好好捋捋，师妹的WB实验总是谜一样操作，不是出现条带拖尾现象，就是出现条带扩散现象，还有经常出现的高背景，或者杂带好几条。我们今天一起梳理梳理，WB实验的前世今生。

免疫印迹又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

我们一起看看WB实验中有哪些步骤流程以及需要注意的事项。

细胞及组织收集

常规的样品无外乎3种，分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。

蛋白定量

WB是要比较同样细胞数量的细胞或同等重量的动物组织中目的蛋白的表达量高低变化。那么首先，我们需要控制样品本身重量大小或细胞数量的多少对实验结果的影响，故不同组间的样本需要控制一致才能提取蛋白。

蛋白定量目前有4种方法，分别是双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。较常用的是BCA法。

SDS-PAGE凝胶制备，蛋白电泳

根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100 kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。

转膜

转膜就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白转膜。

封闭蛋白抗原

一般我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。

抗原抗体反应

一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，比较重要的是一抗孵育温度和时间，最常用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。一抗结合之后，就是采用的二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。

显色

选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。

一套流程体系下来，我们会发现，WB实验需要让我们操心的步骤实在是太多了，而且还有许多的隐藏的小细节，一不小心可能就game over，从头再来。

但是，现在有了WB工具箱这个实验利器，基于传统的WB实验操作繁琐耗时、试剂用品种类繁多、背景高、实验结果稳定性差的痛点，Abbkine开发出通用型免疫印迹（WB）工具箱，经精心设计钻研，一站式操作，即可满足常规WB实验需求，获得极佳的实验结果。

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