蛋白定量是蛋白分离和分析前必须的一个重要步骤，蛋白色谱分离、蛋白质电泳分析、蛋白质免疫分离和分析、细胞裂解释放的总蛋白定量、蛋白分子的标记、蛋白结构分析等，都需要可靠的定量分析作为基础。蛋白定量分析应用的领域包括生物科学，食品检验，临床检验等等。具体在以下情景中我们需要用到蛋白定量实验：

1. 在判断蛋白有无表达时，先将细胞裂解，验证细胞裂解是否彻底，或对样品进行平时实验或者标准化保存，则要对细胞裂解液进行蛋白定量；

2. 判断蛋白的表达情况、产量如何，则需要将已纯化的蛋白定量；

3. 纯化好的蛋白进行下一步的应用，如标记报告酶或者生物素等，也需要先将蛋白定量，以便计算试剂的最佳工作浓度。

下面我们来为大家盘点一下如今最常见的几种蛋白定量方法：

一、紫外法

紫外法也是常用的蛋白定量方法之一，该方法在简单的分光光度计中就可以定量测定溶液中蛋白质的含量。蛋白质对近紫外光的吸收依赖于酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）含量，同时在很小的程度上也会受到苯丙氨酸（Phe）和二硫键数量的影响。因此，蛋白质之间A280的吸收值相差很大，对于浓度为1 mg/mL的溶液，从0到4的数值都有，大多蛋白的吸收值在0.5 - 1.5的范围之间。

二、Bradford法

1.考马斯亮蓝比色法（如KTD3002）

考马斯亮蓝G250是一种有机染料，在游离状态下呈红色，它的最大吸收峰在465nm，在稀释溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸结合后变为蓝色，这种结合具有高敏感性，此时吸收峰也从465nm变为595nm,在一定范围内，光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。其特点如下：

节省时间—几乎立即显色

兼容性—不受大多数化学物质的影响，样品中巯基乙醇和二硫苏糖醇的浓度分别可达1 mM和5 mM

检测范围广—工作范围50-1000 ug/ml

性价比高—良好的性价比，单次实验，成本更低。

Fig.1 Abbkine 蛋白质定量试剂盒（Bradford法）标准曲线。

2. 考马斯亮蓝染色法（如BMU105-CN）

考马斯亮蓝是用于蛋白质（通过蛋白质凝胶电泳分离）可视化的常用染料。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质的碱性和疏水氨基酸残基结合，颜色呈现深蓝色。

Fig.2 SuperKine™ 超快蛋白胶染色液（考马斯亮蓝）染色结果展示。

三、BCA法（如KTD3001）

BCA(Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowary法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。其特点如下：

• 节省时间—显色反应迅速
• 兼容性好—不受大多数化学物质的影响。对于样品中巯基乙醇和二硫苏糖醇的兼容浓度，分别可达0.01%和1 mM。
• 良好的检测范围—检测范围为20 - 2000ug/ml。
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Fig.3 Fig. Abbkine 蛋白质定量试剂盒（BCA法）标准曲线。

以上是针对全蛋白质的“总定量法”，然而许多实验需要对溶液中特定蛋白进行定量分析，即针对特定蛋白质的“个别定量”。针对特定蛋白定量常用的方法有酶联免疫吸附试验法（ELISA），免疫印迹分析法（WB）和质谱检测（MS）。

1、ELISA法（如KET6038、KET6039）

ELISA是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法，通常是在96孔酶标板上进行，关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。具体来说，ELISA有不同变种。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。ELISA是一种广泛用于检测样品中抗原含量的可靠技术。使用Abbkine的ELIKINE试剂盒，准确性和可靠性大大提高。

2、WB（如KTD106-CN）

WB一般适用于半定量。通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开，把蛋白质转膜（硝酸纤维素或PVDF），然后使用特定的酶标抗体检测。最后，加入适当的底物（化学发光底物）产生可检测的信号。虽然WB比ELISA更费时，但是WB不仅可以对特定的蛋白进行定量，而且可以在实验中同时检测蛋白质修饰。使用Abbkine的通用型免疫印迹（WB）工具箱，一站式操作，即可满足常规WB实验需求，获得极佳的实验结果。

3、MS

MS是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白进行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。

常用的方法是较重的稳定同位素碳（13C）或氮（15N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素（12C和14N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值就相当于其相对丰度比。

质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本，即用基质辅助激光解吸/电离 - MALDI分析。使用质谱这种通用方法可以在一次实验中同时进行定量和定性检测。但这种方法需要的检测仪器很昂贵，从而限制了该方法的使用。

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