一、IP免疫沉淀

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

基于抗原抗体特异性结合实现目的蛋白的纯化富集。该方法常用于分析验证蛋白质之间的相互作用。

IP实验过程主要包含3个步骤：

①样本制备：使用非变性裂解液制备组织或细胞蛋白样本；

②免疫沉淀：偶联磁珠的捕获抗体与样本孵育结合，形成免疫沉淀复合物；

③WB验证：特异性检测抗体WB验证目的蛋白的存在。

免疫沉淀复合物的结构：

免疫沉淀复合物主要由三部分组成：Protein A/G，抗体IgG分子，目标蛋白。

在免疫沉淀实验后的WB验证环节中，免疫沉淀复合物SDS-PAGE上样检测后，这些成分都会一起转移到膜上。如图1：

图1.免疫沉淀复合物及电泳示意图（图片来源于网络）

轻重链的产生：

当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候，使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗，会识别捕获抗体变性后的IgG重链和轻链分子，导致出现55kDa重链带，25kDa轻链带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰，影响结果判断。

规避轻重链干扰常见的方法：

选择不同种属来源的捕获抗体和检测抗体分别进行IP和WB实验，同时使用与捕获抗体无交叉反应，只针对检测抗体有种属特异性的二抗进行WB实验。

弊端:

需要购买多个抗体，实验成本较高。

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Abbkine IPKine轻/重链特异性二抗，经过特别的优化，针对目的种属特异性非常高，能够特异性的识别目标种属IgG的轻链或者重链，从而避免重链或者轻链的干扰，同时对其它非目的种属的抗体分子的非特异性结合降到最低。如图2：

图2.普通二抗与Abbkine IPKine轻链特异性二抗WB结果对比

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