原理

线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP），又称线粒体巨型通道（magachannel），是存在于线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白质复合组成。线粒体通透性转换孔（MPTP）可能参与了细胞死亡过程中线粒体成分的释放。正常的细胞线粒体内膜可维持正常的线粒体电位梯度以保证细胞呼吸作用及能量供应，随着Ca²⁺的摄入和释放，一种低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca²⁺的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒是一种相对于仅基于线粒体膜电位分析更直接的检测线粒体通透性转换孔开放的检测方法。其原理是：首先通过被动运输加载Calcein AM，后者是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl₂后，来自胞浆的荧光被CoCl₂淬灭，仅留下线粒体内的荧光。作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl₂ 的同时，对其用Ionomycin处理，从而使细胞加载更多的Ca²⁺，引起线粒体通透性转换孔的激活从而使线粒体荧光淬灭。

自备耗材

·细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

·离心机

·荧光显微镜或流式细胞仪

·PBS

试剂准备

Calcein AM staining solution：每1 mL Assay buffer加入1 μL的Calcein AM (1000X)，混匀。

注意：Calcein AM的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Calcein AM的推荐工作浓度为1×，可以在0.5×-5×之间进行调整。

Fluorescence quenching solution：每1 mL Calcein AM staining solution中加入10 μL的CoCl₂ (100×)，混匀。

注意：CoCl₂的终浓度推荐为1×，通常此时的淬灭效果比较好。CoCl₂的终浓度也可以根据实验中所使用细胞的种类进行适当优化，以摸索出最佳的淬灭效果，可在0.1×-1×之间进行调整。

Ionomycin control：每1 mL Fluorescence quenching solution中加入5 μL的Ionomycin (200×)，混匀。

注意：Ionomycin的终浓度建议为1×，也可以在0.5×-5×之间进行调整。

实验步骤

注意：本试剂盒（100 T）96孔板每孔检测体系100 μL时可以检测1,000 T。

A. 流式细胞术检测

1. 用预期的方法处理细胞；

2. 对于非贴壁细胞，300 g离心5 min收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化细胞，然后300 g离心5 min离心收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。

注意：需准备悬浮在Assay Buffer的细胞样本，用于流式细胞检测时的阴性对照。

3. 分别加入适当体积的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重悬细胞，使细胞密度约为1×10⁶/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

4. 孵育完成后，300g离心5 min收集细胞。每个样品加入1mL Assay Buffer，轻轻重悬，300g离心5 min收集细胞。

5. 用400 μL Assay Buffer重悬细胞后，用流式细胞仪分析。

B. 荧光显微镜检测

1. 对于贴壁细胞：

(1) 在合适的孔板上培养细胞，在CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24 h，再进行后续实验。

(2) 用预期的方法处理细胞，在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组。

(3) 用 PBS 清洗细胞2次。

(4) 分别加入适当体积Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control到细胞中，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

(5) 孵育结束后，更换成新鲜的37℃预热的培养液，37℃再避光孵育30min，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。

(6) 用PBS清洗2-3次，然后加入Assay Buffer即可在荧光显微镜下观察（Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm）。

2. 对于悬浮细胞：

(1) 用预期的方法处理细胞，计数。

(2) 取适当细胞300 g离心5 min，弃上清，用PBS清洗细胞2次，弃去PBS。

(3) 分别加入适当体积的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重悬细胞，使细胞密度约为1×10⁶/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

(4) 300g离心5 min，吸除上清液，缓慢加入1 mL 37℃预热的培养液重悬细胞，37℃再避光孵育30min，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。

(5) 300g离心5 min，吸除大部分培养液，将细胞重悬后涂片，在荧光显微镜下观察。

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