原理

Fluo-4钙离子检测试剂盒是一种基于Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测细胞内钙离子浓度的试剂盒。本试剂盒可以使用荧光显微镜进行荧光成像检测，也可以使用荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光的定量检测。使用荧光显微镜或荧光酶标仪还可以进行细胞内钙离子浓度的动态变化检测。Fluo-4是一种将Fluo-3结构中的Cl离子替换成F离子的钙荧光探针。由于将Cl离子替换成了电子吸引力更强的F离子，它的最大激发波长会向短波长方向偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度比Fluo-3更强。Fluo-4 AM穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光。可以使用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化。

自备耗材

·离心机、细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

·荧光显微镜或流式细胞仪

·PBS或HBSS

试剂准备

Stain Solution：临用前配制，每1 mL Assay buffer加入2 μL Fluo-4 AM (500×)，混匀。

可选做：如果Fluo-4 AM进入细胞的效果不好，可向Stain Solution中加入Staining Enhancer (500×)至终浓度为1×，Staining Enhancer可防止Fluo-4 AM在缓冲液中聚集并促进Fluo-4 AM进入细胞。

实验步骤

A. 流式细胞仪检测

1. 对于非贴壁细胞，300 g离心5 min收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含EDTA）消化细胞，然后300 g离心5 min离心收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。

注意：需准备悬浮在Assay Buffer的细胞样本，用于流式细胞检测时的阴性对照。

2. 用1 mL Stain Solution重悬1×10⁶细胞，37℃避光孵育10-60 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

注意：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37℃孵育30 min，观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。

3. 孵育完成后，可直接进行流式细胞仪检测（FL1/BL1通道），也可300 g离心5 min离心收集细胞，吸弃Stain Solution后每个样本加入0.5 mL Assay Buffer重悬细胞后进行流式细胞仪检测。

B. 荧光显微镜检测

1. 对于贴壁细胞：

(1) 在合适的孔板上培养细胞，在CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24 h，再进行后续实验。

(2) 用PBS清洗细胞2次。

(3) 加入适当体积的Stain Solution到细胞中，通常96孔板每孔加入50 μL，24孔板每孔加入200 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL，37℃避光孵育10-60 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。

注意：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37℃孵育30 min，观察荧光效果。如果细胞死亡较多，则适当缩短时间或降低温度；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。

(4) 孵育结束后，可直接进行荧光显微镜检测（Ex/Em=494/516 nm），也可吸弃Stain Solution，用PBS或HBSS洗涤细胞2-3次后进行荧光显微镜检测。

2. 对于悬浮细胞：

(1) 参照步骤A.1-A.3的流式细胞染色。

(2) 将步骤 A.3的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞，在荧光显微镜下观察。

注意事项

1. 如果使用含有血清的培养基，血清中的酯酶会分解Fluo-4 AM，从而降低Fluo-4 AM进入细胞的效果。另外，含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，加工作液前应尽量去除残留培养基。

2. Ionomycin是一种对钙离子有亲和力的离子载体，细胞经Ionomycin处理数秒内就能观察到绿色荧光强度增加，推荐使用激光共聚焦显微镜连续拍摄来检测细胞内钙离子浓度的变化。

3. Staining Enhancer可降低Fluo-4 AM的稳定性，因此只建议在配制Stain Solution时加入。

4. 本试剂盒对Fluo-4 AM染色浓度做了优化处理，也可根据自身的细胞类型，培养条件以及应用方向来梯度摸索最佳的工作浓度及染色时间，Fluo-4 AM工作浓度可在0.2×-2×调整。

5. Fluo-4 AM遇水极易分解，如果不能一次用完，建议适当分装保存。

6. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓淬灭。

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