样本准备

· 细胞收集：收集细胞时，对于贴壁细胞，尽量采用温和的方法，如胰酶消化后轻轻吹打收集，避免使用剧烈的机械方法，防止 DNA 断裂产生非特异性 ladder。对于悬浮细胞，离心速度和时间要适宜，通常 500-1000rpm 离心 5-10 分钟，防止离心力过大损伤细胞 DNA。

· 细胞数量：确保用于实验的细胞数量足够，一般建议为 1×10⁶ - 1×10⁷个细胞，细胞数量过少可能无法获得足够的 DNA 用于检测，过多则可能超过试剂盒的处理能力，影响抽提效果。

· 细胞状态：细胞应处于健康状态，无明显的细菌、真菌或支原体污染。污染可能会影响细胞凋亡的正常进程，导致 DNA ladder 不典型或出现异常条带。

试剂准备与保存

· 试剂盒保存：试剂盒应按照说明书要求保存在 4℃或 - 20℃，不同试剂盒要求不同，注意避免反复冻融，尤其是含有蛋白酶 K 等酶类的试剂，反复冻融可能导致酶活性降低。

· 试剂平衡：使用前将试剂盒中的试剂从冰箱取出，在室温下平衡 15-30 分钟，使试剂达到室温，确保反应体系的稳定性，特别是裂解液等试剂，温度过低可能影响裂解效果。

· 试剂检查：使用前检查试剂是否有变色、沉淀或浑浊等异常现象，如有则不能使用。例如，如果发现蛋白酶 K 溶液出现沉淀，可能会影响其消化蛋白质的能力，导致 DNA 与蛋白质分离不充分。

实验操作

· 细胞裂解：加入裂解液后，要充分混匀并在适当温度下孵育，确保细胞完全裂解。一般在 50-65℃孵育 1-2 小时，期间可轻轻颠倒离心管数次，使裂解更充分。但要注意避免过度裂解，以免 DNA 被过度降解。

· 蛋白酶 K 使用：按照说明书准确加入蛋白酶 K，其用量和作用时间要严格控制。蛋白酶 K 用量不足可能导致蛋白质消化不完全，影响 DNA 纯度；用量过多或作用时间过长，可能会对 DNA 造成非特异性切割。

· 离心操作：离心步骤的转速和时间要严格按照试剂盒说明书进行。例如，在将裂解液转移到离心柱后，通常在 10000-12000rpm 离心 1-2 分钟，离心速度或时间不足可能导致 DNA 吸附不充分，影响回收率；离心速度过高或时间过长，可能会损坏离心柱膜。

· 洗涤步骤：洗涤离心柱时，要确保洗涤液充分覆盖离心柱膜，以去除杂质。洗涤次数不宜过少，否则杂质去除不彻底，影响 DNA 纯度；但也不宜过多，以免 DNA 损失过多。每次洗涤后要彻底去除残留的洗涤液，可在最后一次离心后，将离心柱开盖放置几分钟，让残留的洗涤液自然挥发。

· DNA 洗脱：洗脱 DNA 时，应将洗脱缓冲液加在离心柱膜的中央，确保缓冲液与膜充分接触，以提高洗脱效率。洗脱缓冲液的用量一般为 50-100μL，可根据实际需要进行调整，但不宜过少，否则可能无法将 DNA 完全洗脱下来。洗脱时可在室温下孵育 1-2 分钟，然后再离心收集 DNA。

结果检测与分析

· 电泳检测：提取的 DNA 通常采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，要注意琼脂糖凝胶的浓度、电泳缓冲液的 pH 值和离子强度等因素对 DNA ladder 条带分辨率的影响。一般采用 1.5%-2% 的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液可选用 TAE 或 TBE 缓冲液。

· 结果判断：正常的细胞凋亡 DNA ladder 应呈现出典型的梯状条带，条带大小一般为 180-200bp 的整数倍。如果条带不清晰或出现拖尾现象，可能是 DNA 降解、杂质残留或电泳条件不合适等原因导致，需要仔细分析实验过程，查找原因并重新实验。

· 阳性对照：为了验证实验体系的有效性，建议同时设置阳性对照，如使用已知处于凋亡状态的细胞样本进行 DNA 抽提和电泳检测。如果阳性对照出现正常的 DNA ladder，而实验样本没有，说明实验样本可能存在问题或实验操作有误。