总胆固醇（TC）含量检测试剂盒实验解决方案
发布时间：2025-02-12
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原理
总胆固醇（TC）包括游离胆固醇和胆固醇酯。组织TC是指组织中所有脂蛋白所含胆固醇之总和。CheKine™ 总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（微量法）提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本如动物组织、细胞、细菌、血清（浆）中TC的含量水平。其原理是利用酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆固醇酯转化为FC；进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化，生成Δ4-胆甾烯酮和H2O2；最后利用过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林和苯酚，生成红色醌类化合物；在500 nm有特征吸收峰，其颜色深浅与TC含量成正比。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计（能测500 nm处的吸光度）
·96孔板和微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·低温离心机、制冰机、水浴锅
·无水乙醇
·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
TC Working Solution：即用型；使用前，平衡到37℃；4℃保存。
Standard：使用前配制，加10 mL无水乙醇充分溶解，浓度为2 μmol/mL，4℃避光分装保存6个月。
标准曲线设置：按下表所示，用无水乙醇将2 μmol/mL标准品稀释至1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031 µmoL/mL。
序号 | 标准品的体积 | 无水乙醇的体积（µL） | 标准品浓度（μmol/mL） |
Std.1 | 200 µL of Standard | 0 | 2 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (2 μmol/mL) | 100 | 1 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (1 μmol/mL) | 100 | 0.5 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.5 μmol/mL) | 100 | 0.25 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.25 μmol/mL) | 100 | 0.125 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.125 μmol/mL) | 100 | 0.063 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.063 μmol/mL) | 100 | 0.031 |
注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
1.动物组织：称取约0.1 g组织，加入1 mL无水乙醇，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
2.细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1 mL无水乙醇，超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
3.血清（浆）：直接测定。
注意：1. 提取液中含有使蛋白变性的成分，若按蛋白浓度计算时，需要重新用裂解液提取蛋白进行测定。2. 如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min，调节波长到500 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2.TC Working Solution在37℃水浴中预热30 min以上。
3.在96孔板或微量玻璃比色皿按照下表进行操作：
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
无水乙醇 | 50 | 0 | 0 |
Standard | 0 | 50 | 0 |
Sample | 0 | 0 | 50 |
TC Working Solution | 150 | 150 | 150 |
4.混匀后室温孵育15 min，于500 nm测定吸光值，记为A空白、A标准、A测定，计算ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白。
注意：空白孔和标准孔只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于2 µmoL/mL标准品的ΔA标，样本可用无水乙醇进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。检测时间不宜超过1 h。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴绘制标准曲线。将ΔA测代入标准曲线公式计算出y（μmol/mL）。
2. 样本TC含量计算
(1) 按样本质量计算
TC含量(μmol/g 鲜重)=y÷(W÷V提取)×n=y÷W×n
(2) 按蛋白浓度计算
TC含量(μmol/mg prot)=y÷Cpr×n
(3) 按细菌或细胞数量计算
TC含量(μmol/104)=y÷(500÷V提取)×n=y÷500×n
(4) 按液体体积计算
TC含量(μmol/mL)=y×n
W：样本质量，g；V提取，加入无水乙醇的体积，1 mL，n：样本的稀释倍数；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
Figure 1. TC标准曲线。
实验实例：
Figure 2. 试剂盒测定动物组织中的TC含量。
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Catalog No. | Product Name |
KTB2200 | CheKine™ 甘油三酯（TG）检测试剂盒（微量法） |
KTB2210 | CheKine™ 游离胆固醇（FC）检测试剂盒（微量法） |
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