胃蛋白酶活性检测试剂盒
发布时间：2025-02-17
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原理
胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。CheKine™ 胃蛋白酶活性检测试剂盒（微量法）可检测动物组织等生物样本。在该试剂盒中，胃蛋白酶可催化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。
自备耗材
·酶标仪或可见光分光光度计（能测580 nm处的吸光度）
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
·水浴锅、低温离心机
·去离子水
·匀浆器或研钵
试剂准备
Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
Working Reagent III：临用前配制；48 T加入6 mL Reagent II，96 T加入12 mL Reagent II，充分溶解，用不完的试剂4℃避光保存1周。
Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入6 mL去离子水，96 T加入12 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃避光保存1周。
Working Reagent V：临用前配制；48 T加入7.5 mL去离子水，96 T加入15 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存1周。
Reagent VI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
注意：Reagent IV、Reagent V和Reagent VI有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。
Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
样本制备
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。
动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到580 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2.将Reagent III、Reagent IV置于37℃水浴预热30 min。
3.操作表（下述操作在1.5 mL离心管中操作）：
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
样本 | 0 | 0 | 20 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 100 |
Working Reagent III | 0 | 0 | 100 | 0 |
置于37℃水浴保温10 min | ||||
Working Reagent IV | 0 | 0 | 100 | 100 |
盖紧后摇匀1 min | ||||
样本 | 0 | 0 | 0 | 20 |
混匀后8,000 g，4℃离心10 min取上清，下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作： | ||||
上清 | 0 | 0 | 20 | 20 |
Standard | 0 | 20 | 0 | 0 |
去离子水 | 20 | 0 | 0 | 0 |
Reagent II | 40 | 40 | 40 | 40 |
Working Reagent V | 120 | 120 | 120 | 120 |
Reagent VI | 20 | 20 | 20 | 20 |
4.混匀后室温静置20 min，记录580 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。
注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
胃蛋白酶活性的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1 nmol酪氨酸定义为一个酶活力单位。
胃蛋白酶(U/mg prot)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样×F÷(Cpr×V样)÷T=550×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
酶活单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1 nmol酪氨酸定义为一个酶活力单位。
胃蛋白酶(U/g 鲜重)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样×F÷(W×V样÷V样总)÷T=550×ΔA测定÷ΔA标准÷W
C标准：标准溶液的浓度，0.5 μmol/mL；F：稀释倍数，(20+100+100)÷20=11；V样总：样本总体积，1 mL；V样：加入的样本体积，0.02 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；W：样本质量，g。
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