SuperKine™ 超敏型细胞增殖检测试剂（CCK-8）

SuperKine™ Maximum Sensitivity Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如：可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
应该每次做标准曲线吗？

建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
如遇到每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
在CCK-8显色过程中，如何终止反应？

有以下几种方法（96孔板）： 1、在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。
CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
哪些物质会影响CCK8的测定？

当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
必须预培养细胞吗？

不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
CCK8检测溶液对细胞是否有毒？

加到培养基中的CCK8是没有毒性的，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。
实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？

建议使用一个孔作一下检测，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
CCK-8试剂的保存条件？

在避光0-5℃条件下可以保存1年。
如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
CCK8能否对活细胞进行染色？

不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上。由于生成的甲瓒也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。

试剂盒组分	即用型CCK-8溶液
特点&优势	•灵敏度高：检测结果更准确 •稳定性好：可-20℃避光冷藏保存2年以上 •安全性高：对细胞毒性较小，对后续实验几乎无影响
产品形式	液体形式
保存建议	4℃，避光保存12个月，-20℃至少24个月
运输条件	冰袋运输（蓝冰）
警告	本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。

产品英文名称	SuperKine™ Maximum Sensitivity Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
产品中文名称	SuperKine™ 超敏型细胞增殖检测试剂（CCK-8）

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