背景

线粒体膜通透性转换孔(MPTP)是位于线粒体内外膜的非特异性通道，似乎参与细胞死亡过程中线粒体成分的释放。MPTP的开关极大地改变了线粒体的渗透性以及线粒体膜电位。这种持续孔隙激活是由线粒体Ca2+超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。MPTP与细胞的生存、凋亡密切相关,对于MPTP的检测也渗透于缺血 / 再灌注、肿瘤、衰老、神经变性等多个领域。我们开发了一款成像显微分析和流式分析于一身的用于检测线粒体转换孔开放的试剂盒——线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒（KTA4002)。

原理

正常情况下线粒体内会维持较高的Ca2+浓度，以利于肌肉的正常兴奋、收缩和舒张，减少胞浆中Ca2+浓度升高对骨骼肌超微结构的破坏，同时也是敏感性线粒体酶（C₃H₆O酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶）发挥功能所必需的。

大多数的线粒体会与内质网有一个接触点，并建立有稳固的连接。有研究表明内质网中Ca2+释放后一部分进入胞浆引起胞浆内Ca2+浓度升高，一部分会被临近的线粒体募集吸收，此时低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞受到损伤时，低电导渗透性转换孔渗透性发生改变，Ca2+ 过载，导致MPTP激活。

此时向该细胞中加入荧光探针——钙黄绿素乙酰甲酯(calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM；一种非极性染料，可以对活细胞进行荧光染色。Calcein AM通过被动运输进入细胞内并在细胞质组分包括线粒体等中积累。Calcein AM在细胞内能被酯酶水解去除乙酰甲酯，生成没有膜通透性的极性荧光染料钙黄绿素(Calcein or Fluorexon)，从而使Calcein滞留在细胞内以及线粒体中，使得细胞质包括线粒体等呈现强绿色荧光)。再加入CoCl2用于淬灭细胞质中Calcein的绿色荧光。正常情况下线粒体的MPTP是关闭的，CoCl2不能进入线粒体，因此在正常细胞中只是胞浆中的Calcein被淬灭；但是损伤的细胞MPTP有一定程度的开放，此时CoCl2便可以进入线粒体，因此在损伤细胞中除了胞浆中的所有Calcein被淬灭外，线粒体中的Calcein也有不同程度的淬灭。此时我们可以通过流式细胞仪检测Calcein的绿色荧光信号，通过比较荧光信号的强度判断MPTP的开放程度，进而推断线粒体的损伤程度。

常见问题解答

Q：加入氯化钴后，细胞质内的荧光不淬灭怎么办呢

A：可适当减少Calcein-AM的浓度和用量。

Q：最后的结果要怎么分析啊，不同亚组间应该如何比较

A：据线粒体中Calcein绿色荧光的强弱来判断线粒体MPTP开放的程度，绿色荧光越强，开放程度越低，绿色荧光越弱开放程度越高。

Q：该试剂盒如何检测MPTP开放程度？

A：本方法比基于线粒体膜电位的方法能更直接地检测到线粒体通透性转换孔开放程度的变化，根据线粒体中Calcein绿色荧光的强弱来判断线粒体MPTP开放的程度，绿色荧光越强，开放程度越低，绿色荧光越弱开放程度越高。实验需要设置阴性对照和阳性对照进行比较，没有灵敏度和检测限数据，荧光显微镜、流式均可检测。

Q：该试剂盒阴性对照和阳性对照如何设置？

A：阴性样本中加入Calcein AM staining solution；阳性样本中加入Ionomycin control。

Q：该试剂盒染色之后是否可以用DAPI染核呢？

A：如果染核推荐Abbkine的Hoechst 33342活细胞染料(BMD0062)。不可固定。

Q：该试剂盒应该选用哪个通道进行检测？

A：选用FITC/488 nm 激发光通道进行检测。

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