TUNEL、DNA损伤、Annexin V、Caspase,细胞凋亡的多维度研究
细胞凋亡是细胞状态研究的热点之一,细胞发生凋亡时,就像树叶或花的自然凋落一样,对于这种生物学观察,借用希腊“Apoptosis”来表示,意思是像树叶或花的自然凋落,可译为细胞凋亡。接下来我们会对细胞凋亡进行精细解读:
细胞凋亡的研究主要从以下四个方向进行:
分类 | 检测方法 |
形态学 | 显微镜观察 |
细胞功能 | 线粒体膜电位检测、Annexin V/PI |
分子标记 | 凋亡分子标记检测、DNA损伤检测 |
蛋白标记 | Caspase蛋白检测 |
1. DNA Ladder检测:细胞凋亡诱导剂A+B(1:1000)诱导后提取DNA电泳可检测到阶梯型条带。
2. DNA断裂损伤检测:细胞 DNA 损伤检测在细胞凋亡中的作用非常关键。DNA 损伤可以由多种因素引起,如紫外线、放射线、化学药物、氧化应激等。当细胞中的 DNA 受到损伤时,细胞会启动一系列信号通路,以决定是修复损伤还是诱导凋亡。
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3. TUNEL检测:细胞死亡(凋亡或坏死)时,DNA发生断裂。此时利用末端脱氧核苷转移酶(TdT),将核苷酸类似物掺入DNA链中,就可用抗体、点击化学(Click chemistry)等方法进行检测。
4. 细胞膜Annexin-V蛋白翻转:Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针标记,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生(绿色)。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染(红色)。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
5.凋亡蛋白Caspase的检测标记:细胞凋亡途径,是由一套明确的信号通路层层调控的。在绝大多数情况下,所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者Caspase-3之上。上游的凋亡信号通过切割Caspase-3,使其具备酶活,并执行最后的凋亡程序。
半胱氨酸蛋白酶的 Caspase 家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物 caspases 可分为三个功能组:启动子半胱天冬酶(Caspase 2、8、9 和 10),执行者半胱天冬酶(Caspase-3、6 和 7)和炎性半胱天冬酶(Caspase 1、4、5、11 和 12)。Caspase-1(ICE,白介素-1β-转换酶)是哺乳动物的 caspase,负责将两种炎性细胞因子白介素 1β 和 IL-18 的蛋白水解成活性细胞因子,从而引发促炎反应。
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