甘油三酯（TG）检测试剂盒实验解决方案
发布时间：2025-02-12
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原理
甘油三酯（Triglyceride, TG）是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，不仅是细胞膜的主要成分，也是重要呼吸底物。血清TG是一项重要的临床血脂常规测定指标。CheKine™甘油三酯（TG）检测试剂盒（微量法）可检测血清（浆）、动植物组织、细胞、细胞上清、细菌等样本中甘油三酯（TG）含量，其原理是用异丙醇抽提样本中TG，KOH皂化TG后水解生成甘油及脂肪酸，过碘酸氧化甘油生成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色物质，在420 nm有特征吸收峰，其颜色的深浅与TG含量成正比。
自备耗材
·酶标仪或可见分光光度计（能测420 nm处的吸光度）
·恒温箱、制冰机、低温离心机
·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
·去离子水、EP管
·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
注意：ReagentⅣ有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
ReagentⅤ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
2.植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
3.细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
4.血清（浆）、细胞上清等液体样本：直接测定。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到420 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2.水浴锅预热到65℃。
3.甘油三酯的提取（下述操作在EP管中操作）：
试剂 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） |
去离子水 | 40 | 0 | 0 |
Standard | 0 | 40 | 0 |
样本上清 | 0 | 0 | 40 |
Extraction Buffer | 125 | 125 | 125 |
ReagentⅠ | 25 | 25 | 25 |
将已处理好的样本上清、Standard、空白对照（去离子水）按照上表分别放于提前标注好的EP管中，加Extraction Buffer后充分混匀，再加ReagentⅠ，剧烈振荡30 s，静置3-5 min后再剧烈震荡30 s，如此反复3次，常温静置一定时间（约5 min），待分层后，取上层溶液15 μL，置于新的EP管中。
注意：加ReagentⅠ后需剧烈震荡，使样本中甘油三酯得到充分提取。
4.甘油三酯含量的测定：
试剂 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） |
上层溶液 | 15 | 15 | 15 |
ReagentⅡ | 50 | 50 | 50 |
ReagentⅢ | 15 | 15 | 15 |
充分混匀，65℃水浴3 min | |||
ReagentⅣ | 50 | 50 | 50 |
50 | 50 | 50 | |
充分混匀，65℃水浴15 min | |||
水浴后，取出EP管，冷却至室温后，吸取100 μL至96孔板或微量玻璃比色皿测定420 nm处吸光度，空白管记为A空，标准管记为A标、测定管记为A测。
注意：空白管和标准管只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果A测大于1.0，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 液体样本中甘油三酯含量：
TG含量(mg/dL)=CStandard×(A测-A空)÷(A标-A空)×100=100×(A测-A空)÷(A标-A空)
2. 动（植）物组织中甘油三酯含量：
（1）按样本蛋白浓度计算：
TG含量(mg/mg prot)= CStandard×V×(A测-A空)÷(A标-A空)÷(Cpr×V)=(A测-A空)÷(A标-A空)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
TG含量(mg/g 鲜重)=CStandard×V×(A测-A空)÷(A标-A空)÷W=(A测-A空)÷(A标-A空)÷W
3. 细胞、细菌中甘油三酯含量：
TG含量(mg/104)=CStandard×(A测-A空)÷(A标-A空)÷500=(A测-A空)÷(A标-A空)÷500
CStandard: 1 mg/mL；100: 1 dL=100 mL；Cpr: 样本蛋白浓度，mg/mL；W: 样本鲜重，g；V: 样品制备加入Extraction Buffer的体积，1 mL；500: 细胞或细菌总数，500万。
结果展示
取40 μL小鼠血清，按照测定步骤操作，测得计算：
A测=0.362，A空=0.168，A标= 0.611；
计算TG含量(mg/dL)=100×(A测-A空)÷(A标-A空)=100×(0.362-0.168)÷(0.611-0.168)=43.79 mg/dL
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