活 / 死细胞双染色试剂盒通常利用两种不同的荧光染料，基于细胞的细胞膜完整性等特性来区分活细胞和死细胞，以下是其常见的实验原理：

基于细胞膜完整性差异

· 活细胞染色原理：活细胞的细胞膜具有完整的选择性通透屏障功能。一些荧光染料，如 Calcein-AM，本身无荧光且为亲脂性，能够自由穿过完整的细胞膜进入细胞内。进入细胞后，细胞内的酯酶会将 Calcein-AM 水解，去除 AM 基团，生成具有绿色荧光的 Calcein。由于活细胞内有丰富的酯酶且细胞膜完整，水解后的 Calcein 无法透出细胞膜，会在细胞内积累，从而使活细胞呈现绿色荧光。

· 死细胞染色原理：死细胞的细胞膜通透性发生改变，失去了选择性通透能力。例如碘化丙啶（PI）等染料，在正常情况下不能透过活细胞的细胞膜，但可以自由进入死细胞。PI 能与细胞内的核酸（主要是 DNA）结合，在激发光的作用下发出红色荧光，从而使死细胞被染成红色。

基于细胞内酶活性差异

· 活细胞染色原理：一些试剂盒利用活细胞内特有的酶活性来标记活细胞。比如荧光素二乙酸酯（FDA），它可被活细胞内的非特异性酯酶水解，产生具有荧光的荧光素，使活细胞发出荧光。活细胞内的这种酶活性较高，能够快速将 FDA 转化为有荧光的产物，从而实现对活细胞的特异性染色。

· 死细胞染色原理：与活细胞不同，死细胞由于细胞结构和功能的破坏，细胞内的酶活性会发生显著变化甚至丧失。在利用酶活性差异进行染色的体系中，死细胞无法像活细胞那样对相应的荧光底物进行有效代谢转化，也就无法产生或只能产生极微弱的荧光信号，从而与活细胞区分开来。

基于线粒体膜电位差异

· 活细胞染色原理：活细胞的线粒体具有正常的膜电位，一些阳离子荧光染料，如 JC-1，在进入活细胞后，会由于线粒体膜电位的存在而聚集在线粒体基质中，形成聚合物，这些聚合物能够发出红色荧光。所以，具有正常线粒体膜电位的活细胞会显示红色荧光。

· 死细胞染色原理：当细胞死亡时，线粒体膜电位会去极化，丧失正常的电位差。此时，JC-1 不能聚集在线粒体中形成聚合物，而是以单体形式存在于细胞内，单体的 JC-1 发出绿色荧光。因此，死细胞会呈现绿色荧光，以此与活细胞相区别。